Organization practice and efficiency of laboratory diagnosis of tuberculosis with an automatic GeneXpert PCR analyzer in the Belgorod Region


Zemlyansky O.A., Tyurina Е.В., Bashkirev A.A.

1Belgorod State National Research University, Belgorod; 2Tuberculosis Dispensary, Belgorod
Objective. To develop : an optimal model and to estimate its efficiency for the laboratory diagnosis of tuberculosis, by applying an automatic GeneXpert PCR analyzer.
Materials and methods. The investigators studied the efficiency of detecting the pathogen of tuberculosis, by using an automatic GeneExpert PCR analyzer versus routine bacteriological methods, and analyzed the coverage rates through patient examination and the proportion of tuberculosis cases diagnosed with the GeneXpert.
Results. The effective organizational model for the detection of tuberculosis, including multidrug resistant tuberculosis, by using the automatic GeneXpert analyzer, was implemented in the Belgorod Region. The coverage rate for new and recurrent pulmonary tuberculosis cases exceeded 70%. More than half of all tuberculosis cases with bacterial excretion were detected using the GeneXpert. The time taken to detect the pathogen of tuberculosis with the GeneXpert averaged 2.3 days. The efficiency of detecting the pathogen of tuberculosis was slightly lower than that of a culture method and accounted for 50.4 and 72.7% for new and recurrent pulmonary tuberculosis cases, respectively. The sensitivity and specificity of the GeneXpert versus routine bacteriological methods in determining the pathogen’s resistance to rifampin in the sputum of new pulmonary tuberculosis cases were as high as 90–95%.
Conclusion. The introduction of the procedure for detecting the pathogen of tuberculosis and determining its resistance to rifampicin with the automatic GeneXpert PCR analyzer into the practice of the phthisiatric service of the Belgorod Region and the elaboration of the optimal model for using the device could ensure a high specificity in the etiological diagnosis of most epidemically dangerous new and recurrent pulmonary tuberculosis cases in the region for a short period beyond 4 days.

В Белгородской области в последние годы сохраняется благополучная эпидемическая ситуация по туберкулезу. Уровень общей заболеваемости туберкулезом снижается: в 2011 г. он составил 40,5 на 100 тыс. населения, в 2012 г. – 39,1, в 2013 г. – 29,3 [1]. Показатель смерт­ности от туберкулеза остается самым низким среди всех регионов РФ: в 2013 г. он составил 2,0 на 100 тыс. населения (средний показатель по РФ – 11,3) [2, 3] .

Однако, несмотря на это, остается высокой доля больных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) возбудителя. Так, в 2011 г. доля больных с МЛУ среди впервые выявленных бациллярных больных составляла 20,5%, в 2012 г. – 19,5%, в 2013 г. – 18,5%. МЛУ среди больных, зарегистрированных на повторные курсы лечения (рецидивы, неудачи или прерывание лечения) возросла с 52,6% в 2011 г. до 56,5% в 2012 г. и в 2013 г. составила 56,7% [4].

Угроза распространения туберкулеза с МЛУ в области требует внедрения лабораторных методов быстрого обнаружения возбудителя и определения его лекарственной устойчивости.

Материалы и методы

В Белгородской области лабораторная диагностика всех случаев туберкулеза проводится централизованно, на базе баклаборатории областного противотуберкулезного диспансера, что обеспечивает достоверность и сокращение сроков исследований, качест­во проведения которых подтверждается ежегодным участием в ФСВОК. В 2013 г. в баклаборатории внедрена в практику методика выявления возбудителя туберкулеза и определения его чувствительности к рифампицину с помощью автоматического ПЦР-анализатора GeneXpert. Учитывая то, что именно организационные моменты во многом определяют эффективность применения методов лабораторной диагностики в рутинной практике, перед лабораторией и фтизиатрической службой области в целом была поставлена задача разработать оптимальную модель использования анализатора GeneXpert в комплексе с существующими бактериологическими методами.

Цель исследования – оценка эффективности и выбор оптимальной модели организации диагностики туберкулеза с использованием автоматического ПЦР-анализатора GeneXpert на примере когорт впервые выявленных больных туберкулезом легких (ТБЛ) и больных с рецидивами заболевания, зарегистрированных в Белгородской области в 2013 г.

Результаты и обсуждение

В 2013 г. в Белгородской области, согласно форме 07-ТБ «Сведения о впервые выявленных больных и рецидивах заболевания туберкулезом», зарегистрировано 373 впервые выявленных случая ТБЛ, из них 234 – с бактериовыделением, и 59 рецидивов (54 – с бактериовыделением). Оценивали охват этих пациентов обследованием с применением автоматического ПЦР-анализатора GeneXpert на этапе диагностики; эффективность выявления возбудителя ТБЛ с использованием GeneXpert по сравнению с методом посева на плотные питательные среды Левенштейна–Йенсена и Финн-II, а также долю случаев заболевания, диагностированных с помощью GeneXpert, в общем количестве случаев ТБЛ с бактериовыделением.

В течение 2013 г. на этапе диагностики по направлению фтизиатров с применением GeneXpert было проведено исследование материала только от 219 (58,7%) впервые выявленных больных ТБЛ и от 32 (54,2%) больных с рецидивами. Причинами недообследования послужили недоверие лечащих врачей к новому методу, особенно на первых этапах, и в ряде случаев – проблемы, связанные со сбором и доставкой материала в лабораторию.

Нами была предложена организационная модель обследования, обеспечивающая максимально возможный охват больных и рациональное расходование реагентов. Она заключается в том, что, помимо направленных фтизиатрами проб, лаборатория самостоятельно отбирала на исследование с помощью GeneXpert аликвоты (0,5 мл) осадков посевного материала от больных, в которых при люминесцентной микроскопии впервые обнаруживалось любое количество кислотоустойчивых микобактерий (КУМ).

Были проанализированы чувствительность и специфичность обнаружения МБТ по сравнению с посевом на плотные среды при исследовании 0,5 мл КУМ-положительных аликвот осадков посевного материала (табл. 1).

Было исследовано 64 аликвоты проб мокроты с обнаруженными КУМ. 58 их них дали положительный результат при обоих методах, 1 аликвота – отрицательный результат при применении GeneXpert, но был получен рост культуры на плотных питательных средах.

Все 59 культур, выросших на плотных питательных средах, были идентифицированы как принад­лежащие к комплексу M. tubercuiosis с помощью используемых в лаборатории рутинных методик [определение сроков роста, наличия кислотоустойчивости (мазок с окраской по Циль-Нильсену), роста на средах с салициловокислым натрием или паранитробензойной кислотой; иммунохромато­графический тест для качественного определения антигена МРТ64 M. tubercuiosis].

5 проб мокроты с единичными КУМ, обнаруженными при люминесцентной микроскопии, дали отрицательный результат как при применении GeneXpert, так и при исследовании методом посева.

Таким образом, показатели чувствительности и специфичности обнаружения возбудителя ТБЛ, полученные при исследовании 0,5 мл аликвот осадков посевного материала с использованием GeneXpert, по сравнению с посевом на плотные среды составили соответственно 98,3 и 100%, что позволило использовать предложенную организационную модель обследования больных и в дальнейшем.

При использовании данной модели на исследование был взят и материал от больных, по какой-либо причине не направленный лечащим врачом, и материал от олигобациллярных больных, имевших ранее отрицательный результат исследования с использованием GeneXpert, поскольку МБТ обнаруживались у них не в каждой пробе мокроты и в очень небольших количествах.

Благодаря данной организационной модели помимо пациентов, направленных фтизиатрами, в 2013 г. с помощью GeneXpert было обследовано еще 47 впервые выявленных больных ТБЛ и 12 пациентов с рецидивами заболевания. В итоге охват обследованием впервые выявленных больных ТБЛ вырос до 71,3%, больных с рецидивами – до 74,6%.

Нами проанализирована эффективность выявления МБТ с использованием в GeneXpert по сравнению с посевом на плотные среды у впервые выявленных больных и у больных с рецидивами ТБЛ (табл. 2). Анализ проводили в рамках диаг­ностической серии из 3–4 проб мокроты, взятых у пациента до начала лечения.

В 2013 г. обследовано при помощи GeneXpert и методом посева 266 впервые выявленных больных ТБЛ. МБТ обнаружены соответственно у 134 (50,4%) и 178 (66,9%) больных. Из 44 обследованных с рецидивами ТБЛ МБТ обнаружены у 32 (72,7%) и 39 (88,6%) больных.

Таким образом, эффективность обнаружения МБТ при использовании GeneXpert ниже, чем методом посева. Разница составила 16,5% у впервые выявленных больных и 15,8% у больных с рецидивами ТБЛ.

Оба метода продемонстрировали более высокую эффективность у больных с рецидивами ТБЛ, так как в этим случае преобладают формы заболевания с обильным бактериовыделением.

Следует отметить, что сравнивать эти 2 метода не совсем корректно, поскольку они изначально находятся в неравных условиях по кратности исследования. Согласно действующей нормативной документации, в целях диагностики методом посева исследуют 3 пробы мокроты, при использовании же GeneXpert, учитывая стоимость расходных материалов, – 1 или (редко) 2 пробы. Поэтому в случае олигобациллярности у больного или при некачественном сборе мокроты вероятность обнаружения МБТ методом посева выше.

Как и другие молекулярно-генетические методы исследования, использование GeneXpert опережает культуральный метод по скорости получения результатов. Нами были проанализированы сроки выявления возбудителя ТБЛ и его устойчивости к рифампицину с того момента, когда больной попадает в поле зрения фтизиатра.

Из 166 пациентов (134 впервые выявленных и 32 с рецидивами), у которых в 2013 г. при применении GeneXpert на этапе диагностики была обнаружена ДНК МБТ, в первый день результат был получен у 59 (35,4%) пациентов. В абсолютном большинстве это были больные, находившиеся на первичном амбулаторном приеме у фтизиатра в областном противотуберкулезном диспансере.

У 26 (15,7%) больных ДНК МБТ выявлена на второй день от начала диагностики. В основном это касалось материала, направленного в лабораторию фтизиатрами сельских районов, и дополнительное время потребовалось на доставку проб.

У 52 (31,3%) пациентов результат был получен на третий день, у 29 (17,5%) – на четвертый. Большинство исследований проведено из аликвот КУМ-положительных осадков посевного материала, самостоятельно отобранных лабораторией.

Таким образом, сроки выявления ДНК МБТ с использованием GeneXpert варьировали от 1 до 4 дней от начала обследования больного у фтизиатра, в среднем этот показатель составил 2,3 дня. Хотя короткое время исследования является весьма ценным для лечащего врача-фтизиатра, на практике ряд причин организационного (и не только) характера ведет к увеличению сроков диагностики. Это некачественный сбор мокроты, проблемы, связанные с доставкой материала в лабораторию, олигобациллярность у больного.

В 2013 г. доля случаев впервые выявленного ТБЛ, диагностированных при помощи GeneXpert, составила 57,3% от общего числа случаев ТБЛ с бактериовыделением (134 из 234), доля рецидивов – 59,3% (32 из 54 случаев с бактериовыделением). Таким образом, более половины случаев эпидемиологически опасных случаев заболевания с бактериовыделением были выявлены в первые дни диагностики. Это значительно снизило риск распространения ТБЛ, в том числе лекарственно-устойчивого, среди населения области.

Определяли также чувствительность и специфичность выявления устойчивости возбудителя ТБЛ к рифампицину при применении GeneXpert в сравнении с тестами на лекарственную чувствительность методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна–Йенсена (табл. 3 и 4). Аналогично предыдущему исследованию сравнение проводили в рамках диагностической серии из 3–4 проб мокроты, взятых у больного до начала лечения.

В 2013 г. на этапе первичной диагностики определяли лекарственную устойчивость к рифампицину с помощью GeneXpert и методом абсолютных концентраций у 131 впервые выявленного больного ТБЛ. Методом абсолютных концентраций устойчивость к рифампицину обнаружена у 27 больных, из них у 2 при обследовании с использованием GeneXpert она не выявлена. Чувствительность GeneXpert в данных исследованиях составила 92,6%. У 7 больных с устойчивостью к рифампицину, выявленной с использованием GeneXpert, методом абсолютных концентраций устойчивости не обнаружено. Специфичность исследований с использованием GeneXpert – 93,3%.

В 2013 г. на этапе диагностики получены результаты определения лекарственной устойчивости к рифампицину с помощью GeneXpert и методом абсолютных концентраций у 32 больных с рецидивами ТБЛ. Методом абсолютных концентраций устойчивость к рифампицину обнаружена у 17 больных, из них у 4 при обследовании с использованием GeneXpert она не выявлена. Чувствительность GeneXpert в данных исследованиях составила только 76,5%. У 1 больного с устойчивостью к рифампицину, выявленной с использованием GeneXpert, методом абсолютных концентраций устойчивости не обнаружено. Специфичность исследований с использованием GeneXpert – 93,3%.

Относительно низкий (76,5%) показатель чувст­вительности исследований с использованием GeneXpert по выявлению мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину, среди больных с рецидивами может быть связан с тем, что у пациентов, которым ранее проводили противотуберкулезную терапию, возможно присутствие нескольких штаммов возбудителя ТБЛ.

Выводы

  1. В Белгородской области применена эффективная организационная модель выявления ТБЛ с использованием автоматического анализатора GeneXpert. При этом в 2013 г. охват обследованием впервые выявленных больных ТБЛ составил 71,3%, больных с рецидивами заболевания – 74,6%. Эффективность обнаружения МБТ у впервые выявленных больных составила 50,4%, что на 16,5% ниже результатов, полученных методом посева; у больных с рецидивами – 72,7%, что на 15,8% ниже, чем при методе посева.
  2. Срок выявления возбудителя ТБЛ и мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину, при использовании GeneXpert составил в среднем 2,3 дня.
  3. Более половины эпидемиологически опасных случаев ТБЛ с бактериовыделением (57,3% впервые выявленных случаев ТБЛ и 59,3% рецидивов) было выявлено при помощи GeneXpert в первые дни диагностики.
  4. Чувствительность и специфичность выявления устойчивости возбудителя ТБЛ к рифампицину у впервые выявленных больных при использовании GeneXpert в сравнении с методом абсолютных концентраций составили соответственно 92,6 и 93,3%, у больных с рецидивами ТБЛ – 76,5 и 93,3%.
  5. Внедрение в практику фтизиатрической службы области методики выявления возбудителя ТБЛ и определения его чувствительности к рифампицину как генетического маркера МЛУ с помощью автоматического ПЦР-анализатора GeneXpert, разработка оптимальной модели использования прибора позволили в короткие сроки (до 4 суток) с высокой специфичностью обеспечить этиологическую диагностику большинства эпидемически опасных новых случаев ТБЛ и рецидивов заболевания в области.


Literature



  1. Башкирев А.А., Землянский О.А. Особенности эпидемиологического процесса туберкулеза на территории Белгородской области. Научные ведомости БелГУ № 16 (135) 2012. Вып. 19: 100–103.

  2. Белиловский Е. М., Борисов С. Е., Сон И.М., Нечаева О.Б., Галкин В.Б., Баласанянц Г.С., Данилова И.Д., Пашкевич Д.Д. Заболеваемость туберкулезом в Российской Федерации. В кн.: Туберкулез в Российской Федерации 2010 г.: аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской Федерации. М., 2011; 22–60.

  3. Нечаева О.Б., Бирагова О.К. Эпидемическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации. Электронный научный журнал «Социальные аспекты здоровья населения» 2013: 5(33). http://www. vestnik.mednet.ru.

  4. Башкирев А.А., Землянский О.А., Малыхина Т.И. Опыт внедрения программы мониторинга очагов туберкулеза на территории Белгородской области и оценки эффективности проводимых мероприятий. Научные ведомости БелГУ № 11(154) 2013. Вып. 22: 228–231.


About the Autors


Prof. Zemlyansky Oleg Alekseevich, MD; Department of Medical Preventive Disciplines, Belgorod State National Research University
Address: 85, Pobeda St., Belgorod 308015
E-mail: oleg_zeml@list.ru


Similar Articles


Бионика Медиа