В Белгородской области в последние годы сохраняется благополучная эпидемическая ситуация по туберкулезу. Уровень общей заболеваемости туберкулезом снижается: в 2011 г. он составил 40,5 на 100 тыс. населения, в 2012 г. – 39,1, в 2013 г. – 29,3 [1]. Показатель смерт­ности от туберкулеза остается самым низким среди всех регионов РФ: в 2013 г. он составил 2,0 на 100 тыс. населения (средний показатель по РФ – 11,3) [2, 3] .

Однако, несмотря на это, остается высокой доля больных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) возбудителя. Так, в 2011 г. доля больных с МЛУ среди впервые выявленных бациллярных больных составляла 20,5%, в 2012 г. – 19,5%, в 2013 г. – 18,5%. МЛУ среди больных, зарегистрированных на повторные курсы лечения (рецидивы, неудачи или прерывание лечения) возросла с 52,6% в 2011 г. до 56,5% в 2012 г. и в 2013 г. составила 56,7% [4].

Угроза распространения туберкулеза с МЛУ в области требует внедрения лабораторных методов быстрого обнаружения возбудителя и определения его лекарственной устойчивости.

Материалы и методы

В Белгородской области лабораторная диагностика всех случаев туберкулеза проводится централизованно, на базе баклаборатории областного противотуберкулезного диспансера, что обеспечивает достоверность и сокращение сроков исследований, качест­во проведения которых подтверждается ежегодным участием в ФСВОК. В 2013 г. в баклаборатории внедрена в практику методика выявления возбудителя туберкулеза и определения его чувствительности к рифампицину с помощью автоматического ПЦР-анализатора GeneXpert. Учитывая то, что именно организационные моменты во многом определяют эффективность применения методов лабораторной диагностики в рутинной практике, перед лабораторией и фтизиатрической службой области в целом была поставлена задача разработать оптимальную модель использования анализатора GeneXpert в комплексе с существующими бактериологическими методами.

Цель исследования – оценка эффективности и выбор оптимальной модели организации диагностики туберкулеза с использованием автоматического ПЦР-анализатора GeneXpert на примере когорт впервые выявленных больных туберкулезом легких (ТБЛ) и больных с рецидивами заболевания, зарегистрированных в Белгородской области в 2013 г.

Результаты и обсуждение

В 2013 г. в Белгородской области, согласно форме 07-ТБ «Сведения о впервые выявленных больных и рецидивах заболевания туберкулезом», зарегистрировано 373 впервые выявленных случая ТБЛ, из них 234 – с бактериовыделением, и 59 рецидивов (54 – с бактериовыделением). Оценивали охват этих пациентов обследованием с применением автоматического ПЦР-анализатора GeneXpert на этапе диагностики; эффективность выявления возбудителя ТБЛ с использованием GeneXpert по сравнению с методом посева на плотные питательные среды Левенштейна–Йенсена и Финн-II, а также долю случаев заболевания, диагностированных с помощью GeneXpert, в общем количестве случаев ТБЛ с бактериовыделением.

В течение 2013 г. на этапе диагностики по направлению фтизиатров с применением GeneXpert было проведено исследование материала только от 219 (58,7%) впервые выявленных больных ТБЛ и от 32 (54,2%) больных с рецидивами. Причинами недообследования послужили недоверие лечащих врачей к новому методу, особенно на первых этапах, и в ряде случаев – проблемы, связанные со сбором и доставкой материала в лабораторию.

Нами была предложена организационная модель обследования, обеспечивающая максимально возможный охват больных и рациональное расходование реагентов. Она заключается в том, что, помимо направленных фтизиатрами проб, лаборатория самостоятельно отбирала на исследование с помощью GeneXpert аликвоты (0,5 мл) осадков посевного материала от больных, в которых при люминесцентной микроскопии впервые обнаруживалось любое количество кислотоустойчивых микобактерий (КУМ).

Были проанализированы чувствительность и специфичность обнаружения МБТ по сравнению с посевом на плотные среды при исследовании 0,5 мл КУМ-положительных аликвот осадков посевного материала (табл. 1).

Было исследовано 64 аликвоты проб мокроты с обнаруженными КУМ. 58 их них дали положительный результат при обоих методах, 1 аликвота – отрицательный результат при применении GeneXpert, но был получен рост культуры на плотных питательных средах.

Все 59 культур, выросших на плотных питательных средах, были идентифицированы как принад­лежащие к комплексу M. tubercuiosis с помощью используемых в лаборатории рутинных методик [определение сроков роста, наличия кислотоустойчивости (мазок с окраской по Циль-Нильсену), роста на средах с салициловокислым натрием или паранитробензойной кислотой; иммунохромато­графический тест для качественного определения антигена МРТ64 M. tubercuiosis].

5 проб мокроты с единичными КУМ, обнаруженными при люминесцентной микроскопии, дали отрицательный результат как при применении GeneXpert, так и при исследовании методом посева.

Таким образом, показатели чувствительности и специфичности обнаружения возбудителя ТБЛ, полученные при исследовании 0,5 мл аликвот осадков посевного материала с использованием GeneXpert, по сравнению с посевом на плотные среды составили соответственно 98,3 и 100%, что позволило использовать предложенную организационную модель обследования больных и в дальнейшем.

При использовании данной модели на исследование был взят и материал от больных, по какой-либо причине не направленный лечащим врачом, и материал от олигобациллярных больных, имевших ранее отрицательный результат исследования с использованием GeneXpert, поскольку МБТ обнаруживались у них не в каждой пробе мокроты и в очень небольших количествах.

Благодаря данной организационной модели помимо пациентов, направленных фтизиатрами, в 2013 г. с помощью GeneXpert было обследовано еще 47 впервые выявленных больных ТБЛ и 12 пациентов с рецидивами заболевания. В итоге охват обследованием впервые выявленных больных ТБЛ вырос до 71,3%, больных с рецидивами – до 74,6%.

Нами проанализирована эффективность выявления МБТ с использованием в GeneXpert по сравнению с посевом на плотные среды у впервые выявленных больных и у больных с рецидивами ТБЛ (табл. 2). Анализ проводили в рамках диаг­ностической серии из 3–4 проб мокроты, взятых у пациента до начала лечения.

В 2013 г. обследовано при помощи GeneXpert и методом посева 266 впервые выявленных больных ТБЛ. МБТ обнаружены соответственно у 134 (50,4%) и 178 (66,9%) больных. Из 44 обследованных с рецидивами ТБЛ МБТ обнаружены у 32 (72,7%) и 39 (88,6%) больных.

Таким образом, эффективность обнаружения МБТ при использовании GeneXpert ниже, чем методом посева. Разница составила 16,5% у впервые выявленных больных и 15,8% у больных с рецидивами ТБЛ.

Оба метода продемонстрировали более высокую эффективность у больных с рецидивами ТБЛ, так как в этим случае преобладают формы заболевания с обильным бактериовыделением.

Следует отметить, что сравнивать эти 2 метода не совсем корректно, поскольку они изначально находятся в неравных условиях по кратности исследования. Согласно действующей нормативной документации, в целях диагностики методом посева исследуют 3 пробы мокроты, при использовании же GeneXpert, учитывая стоимость расходных материалов, – 1 или (редко) 2 пробы. Поэтому в случае олигобациллярности у больного или при некачественном сборе мокроты вероятность обнаружения МБТ методом посева выше.

Как и другие молекулярно-генетические методы исследования, использование GeneXpert опережает культуральный метод по скорости получения результатов. Нами были проанализированы сроки выявления возбудителя ТБЛ и его устойчивости к рифампицину с того момента, когда больной попадает в поле зрения фтизиатра.

Из 166 пациентов (134 впервые выявленных и 32 с рецидивами), у которых в 2013 г. при применении GeneXpert на этапе диагностики была обнаружена ДНК МБТ, в первый день результат был получен у 59 (35,4%) пациентов. В абсолютном большинстве это были больные, находившиеся на первичном амбулаторном приеме у фтизиатра в областном противотуберкулезном диспансере.

У 26 (15,7%) больных ДНК МБТ выявлена на второй день от начала диагностики. В основном это касалось материала, направленного в лабораторию фтизиатрами сельских районов, и дополнительное время потребовалось на доставку проб.

У 52 (31,3%) пациентов результат был получен на третий день, у 29 (17,5%) – на четвертый. Большинство исследований проведено из аликвот КУМ-положительных осадков посевного материала, самостоятельно отобранных лабораторией.

Таким образом, сроки выявления ДНК МБТ с использованием GeneXpert варьировали от 1 до 4 дней от начала обследования больного у фтизиатра, в среднем этот показатель составил 2,3 дня. Хотя короткое время исследования является весьма ценным для лечащего врача-фтизиатра, на практике ряд причин организационного (и не только) характера ведет к увеличению сроков диагностики. Это некачественный сбор мокроты, проблемы, связанные с доставкой материала в лабораторию, олигобациллярность у больного.

В 2013 г. доля случаев впервые выявленного ТБЛ, диагностированных при помощи GeneXpert, составила 57,3% от общего числа случаев ТБЛ с бактериовыделением (134 из 234), доля рецидивов – 59,3% (32 из 54 случаев с бактериовыделением). Таким образом, более половины случаев эпидемиологически опасных случаев заболевания с бактериовыделением были выявлены в первые дни диагностики. Это значительно снизило риск распространения ТБЛ, в том числе лекарственно-устойчивого, среди населения области.

Определяли также чувствительность и специфичность выявления устойчивости возбудителя ТБЛ к рифампицину при применении GeneXpert в сравнении с тестами на лекарственную чувствительность методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна–Йенсена (табл. 3 и 4). Аналогично предыдущему исследованию сравнение проводили в рамках диагностической серии из 3–4 проб мокроты, взятых у больного до начала лечения.

В 2013 г. на этапе первичной диагностики определяли лекарственную устойчивость к рифампицину с помощью GeneXpert и методом абсолютных концентраций у 131 впервые выявленного больного ТБЛ. Методом абсолютных концентраций устойчивость к рифампицину обнаружена у 27 больных, из них у 2 при обследовании с использованием GeneXpert она не выявлена. Чувствительность GeneXpert в данных исследованиях составила 92,6%. У 7 больных с устойчивостью к рифампицину, выявленной с использованием GeneXpert, методом абсолютных концентраций устойчивости не обнаружено. Специфичность исследований с использованием GeneXpert – 93,3%.

В 2013 г. на этапе диагностики получены результаты определения лекарственной устойчивости к рифампицину с помощью GeneXpert и методом абсолютных концентраций у 32 больных с рецидивами ТБЛ. Методом абсолютных концентраций устойчивость к рифампицину обнаружена у 17 больных, из них у 4 при обследовании с использованием GeneXpert она не выявлена. Чувствительность GeneXpert в данных исследованиях составила только 76,5%. У 1 больного с устойчивостью к рифампицину, выявленной с использованием GeneXpert, методом абсолютных концентраций устойчивости не обнаружено. Специфичность исследований с использованием GeneXpert – 93,3%.

Относительно низкий (76,5%) показатель чувст­вительности исследований с использованием GeneXpert по выявлению мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину, среди больных с рецидивами может быть связан с тем, что у пациентов, которым ранее проводили противотуберкулезную терапию, возможно присутствие нескольких штаммов возбудителя ТБЛ.

Выводы

1. В Белгородской области применена эффективная организационная модель выявления ТБЛ с использованием автоматического анализатора GeneXpert. При этом в 2013 г. охват обследованием впервые выявленных больных ТБЛ составил 71,3%, больных с рецидивами заболевания – 74,6%. Эффективность обнаружения МБТ у впервые выявленных больных составила 50,4%, что на 16,5% ниже результатов, полученных методом посева; у больных с рецидивами – 72,7%, что на 15,8% ниже, чем при методе посева.
2. Срок выявления возбудителя ТБЛ и мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину, при использовании GeneXpert составил в среднем 2,3 дня.
3. Более половины эпидемиологически опасных случаев ТБЛ с бактериовыделением (57,3% впервые выявленных случаев ТБЛ и 59,3% рецидивов) было выявлено при помощи GeneXpert в первые дни диагностики.
4. Чувствительность и специфичность выявления устойчивости возбудителя ТБЛ к рифампицину у впервые выявленных больных при использовании GeneXpert в сравнении с методом абсолютных концентраций составили соответственно 92,6 и 93,3%, у больных с рецидивами ТБЛ – 76,5 и 93,3%.
5. Внедрение в практику фтизиатрической службы области методики выявления возбудителя ТБЛ и определения его чувствительности к рифампицину как генетического маркера МЛУ с помощью автоматического ПЦР-анализатора GeneXpert, разработка оптимальной модели использования прибора позволили в короткие сроки (до 4 суток) с высокой специфичностью обеспечить этиологическую диагностику большинства эпидемически опасных новых случаев ТБЛ и рецидивов заболевания в области.