Специфические показатели врожденного и адаптивного иммунитета к возбудителям пневмококковой и гемофильной инфекций у новорожденных детей


Сависько А.А., Костинов М.П., Харсеева Г.Г., Ястребова Н.Е., Шмитько А.Д., Иванова И.А., Лабушкина А.В.

1Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России, Ростов-на-Дону; 2НИИ вакцин и сывороток РАМН им. И.И. Мечникова, Москва; 3Ростовский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону
Цель исследования. Оценка роли факторов естественного и адаптивного иммунитета к возбудителям S. рneumoniae и H. influenzae типа b у новорожденных в зависимости от отягощенности инфекционного анамнеза их матерей.
Материалы и методы. Обследовано 140 детей, рожденных от матерей, перенесших во время беременности инфекционно-воспалительные заболевания (1-я группа) и 40 детей от матерей с благоприятным анамнезом (2-я группа). Под влиянием 23-валентной полисахаридной пневмококковой вакцины (Пневмо 23) и полисахаридной конъюгированной вакцины для профилактики инфекции, вызываемой H. influenzae типа b (Акт-Хиб), определяли уровень экспрессии TLR2, TLR4 и продукции цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α) на мононуклеарных клетках пуповинной крови, в сыворотке крови при помощи ИФА выявляли содержание IgG к белкам наружной мембраны S. рneumoniae и H. influenzae типа b.
Результаты. Различий по уровню экспрессии TLR2 и TLR4 под воздействием вакцин у детей обеих групп выявлено не было. Функциональная активность пуповинной крови, оцениваемая по синтезу провоспалительных цитокинов в супернатантах культур клеток, имела достоверные различия. Так, в 1-й группе новорожденных синтез цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-6 был выше (р < 0,05), чем во 2-й. Установлены более низкие значения антител IgG к S. рneumoniae и H. influenzae типа b у детей 1-й группы (р < 0,05).
Заключение. Выявленные отличия функциональных показателей врождённого и адаптивного иммунитета в виде высокой активности провоспалительных цитокинов при низком уровне противопневмококковых и противогемофильных антител IgG у детей, рожденных от матерей с отягощенным инфекционным анамнезом, вероятно, имеют важное патогенетическое и прогностическое значение, дают основание отнести новорожденных к группе высокого инфекционного риска и могут быть использованы при персонализированных подходах к проведению их вакцинации.

В последние годы возрастает интерес к изучению роли условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) в инициации различных заболеваний [1, 2]. Это связано со значительным увеличением удельного веса инфекций и расширением спектра клинических проявлений заболеваний, вызываемых УПМ, на фоне нарушений механизмов защиты организма [3]. Рост заболеваемости, обусловленной УПМ, происходит не только среди иммунокомпрометированных лиц с выраженными иммунными нарушениями, но и среди иных групп населения (беременные, родильницы, дети грудного и раннего возраста) [4, 5]. На сегодняшний день основными бактериальными возбудителями болезней у детей раннего возраста продолжают оставаться пневмотропные УПМ – Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae типа b, занимающие лидирующие позиции среди причин детской смертности [6]. По данным ВОЗ, более 1,6 млн человек ежегодно умирает от пневмококковой и гемофильной инфекции, причем 1 млн из них – дети в возрасте до 5 лет. Наиболее высокие показатели заболеваемости регистрируются среди детей младшего возраста, поэтому они являются основной целевой группой для проведения вакцинации.

До настоящего времени не до конца изучены патогенетически значимые механизмы развития данных заболеваний, продолжается поиск ранних прогностических критериев, позволяющих формировать группы риска развития и хронизации бактериальной инфекции, вызванной условно-патогенными микроорганизмами у новорожденных детей [2].

Одним из перспективных направлений является изучение системы врожденного иммунитета, в частности, группы Toll-подобных рецепторов (TLR) [7–9], которые осуществляют распознавание молекулярных паттернов, ассоциированных с различными микроорганизмами, запуская эффекторные механизмы врожденного иммунитета [10–12]. Активация TLR приводит к индукции широкого спектра биологических реакций, в том числе синтеза провоспалительных цитокинов и Т-клеточной активации, определяющей развитие адаптивного иммунного ответа [12].

Цель исследования – оценка роли факторов естест­венного (уровень экспрессии TLR2, TLR4, провоспалительных цитокинов) и адаптивного (содержание антител IgG) иммунитета к возбудителям S. рneumoniae и H. influenzae типа b у новорожденных детей в зависимости от отягощенности инфекционного анамнеза их матерей.

Материалы и методы

Обследованы 180 новорожденных, родившихся от женщин активного репродуктивного периода в возрасте от 18 до 44 лет (средний возраст – 27,2 ± 0,7 года) в МБУЗ «Родильный дом № 2» г. Ростова-на-Дону.

На основании инфекционного анамнеза были выделены 2 клинические группы новорожденных. В 1-ю группу были включены 140 новорожденных, у матерей которых во время беременности были верифицированы различные инфекционно-воспалительные заболевания. Так, у 30 (16,7%) женщин наблюдали один или несколько эпизодов ОРЗ с развитием острых или обострением хронических очагов инфекции ЛОР-органов, у 75 (41,7%) – острые или обострения хронических инфекционно-воспалительных заболеваний органов мочеполовой системы. У 35 (19,4%) женщин одновременно были зарегистрированы изменения ЛОР-органов, дыхательной и мочеполовой системы. Во 2-ю группу вошли 40 новорожденных с благоприятным инфекционным анамнезом, у матерей которых во время беременности не развивались патологии инфекционно-воспалительного генеза. Обследование проводили с информированного согласия родителей. Материалом для исследования явилась пуповинная кровь.

У новорожденных 1-й и 2-й групп исследовали экспрессию TLR на мононуклеарных клетках (МНК) пуповинной крови и продукцию провоспалительных цитокинов в супернатантах культур клеток. В пуповинной крови новорожденных влияние вакцинных препаратов – 23-валентной полисахаридной пневмококковой вакцины (ППВ23) Пневмо 23 и полисахаридной конъюгированной вакцины для профилактики инфекции, вызываемой H. influenzae типа b, Акт-Хиб («Санофи Пастер», Франция) – определяли по уровню экспрессии TLR2, TLR4 и продукции цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α). Для этого из гепаринизированной пуповинной крови (25 ЕД на 1 мл крови) выделяли МНК в градиенте плотности фиколла-урографина. МНК культивировали в полной культуральной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 25 мМ НЕPES (НПП «ПанЭко», Россия), 2 мМ L-глутамина (НПП «ПанЭко», Россия), 100 мкг/мл гентамицина (НПП «ПанЭко», Россия) при температуре 37 °С в атмосфере с 5% СО2. Рабочая концентрация МНК составила 1 х 106 клеток/мл.

Для определения экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови МНК инкубировали с FITC-мечеными антителами к TLR2 и TLR4 («Hycult Вiotech», Нидерланды) и с соответствующими изотипическими контролями в течение 30 мин. при температуре 4 °С. Анализ экспрессии проводили на многофункциональном ридере Synergy ТМ2. Оценивали среднюю интенсивность флюоресценции, величину выражали в условных единицах флюоресценции (у. е.). В качестве лигандов TLR использовали вышеуказанные вакцинные препараты. Оптимальные дозы препаратов были выбраны на основании результатов предварительного исследования. Спонтанную выработку цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО- α) определяли, культивируя МНК в полной культуральной среде RPMI-1640 без добавления стимуляторов. По окончании культивирования лимфоциты осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 мин.

Продукцию цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α) определяли в супернатантах культур клеток методом ИФА (иммуноферментные тест-системы фирмы «Вектор-Бест», Новосибирск).

Исследование факторов адаптивного иммунитета проводили у новорожденных 1-й и 2-й групп. В сыворотке пуповинной крови методом ИФА определяли содержание IgG к белкам наружной мембраны S. pneumoniae и H. influenzae типа b. Для проведения ИФА использовали иммуноферментную систему производства НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова [13].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов Microsoft Exel 2000 и Statistica для Windows XP с использованием параметрических и непараметрических методов статистики. При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартную ошибку (M ± m). Достоверность полученных данных оценивали при уровне значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение

При стимуляции клеточной культуры МНК вакцинными препаратами через 24 ч антигенного воздействия наблюдали повышение уровня экспрессии ТLR2 и ТLR4 в обеих клинических группах.

При проведении дальнейшего анализа влияния вакцин на уровень экспрессии TLR2, TLR4 и продукции цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α) рассчитывали коэффициенты стимуляции (КС). За единицу принимали уровень спонтанной экспрессии TLR и продукции цитокинов. КС рассчитывали как отношение показателей стимулированной экспрессии TLR2, TLR4 и концентрации цитокинов к показателям спонтанной экспрессии, что позволило определить их прирост и повысить стандартизацию метода.

При определении средних значений КС было установлено, что ППВ23 оказывала незначительный стимулирующий эффект на уровень экспрессии TLR в обеих исследуемых группах (табл. 1).

Необходимо отметить, что не было выявлено различий между значениями КС у детей 1-й (КС TLR2 – 1,21 ± 0,1, TLR4 – 1,22 ± 0,1) и 2-й группы (КС TLR2 – 1,17 ± 0,05, TLR4 – 1,22 ± 0,1). Кроме того, не было установлено различий при рассмотрении КС между TLR2 и TLR4.

Аналогичные данные были получены и при использовании вакцины Акт-Хиб (табл. 2). В 1-й группе КС TLR2 составил 1,24 ± 0,08, TLR4 –1,27 ± 0,07, во 2-й – 1,44 ± 0,1 и 1,30 ± 0,1 соответственно.

Достоверных отличий в уровне экспрессии TLR2 и TLR4, стимулированных изучаемыми вакцинами, установить не удалось.

Определение функциональной активности TLR по величине КС продукции цитокинов в стимулированной культуре МНК оказалось более информативным.

Так, при использовании вакцины ППВ23 (см. табл. 1) показатели КС продукции ИЛ-1β были выше в 1-й группе по сравнению со 2-й: 1,80 ± 0,5 и 0,57 ± 0,1 соответственно (р < 0,05). Аналогичные изменения были установлены и в отношении ИЛ-6: КС у новорожденных 1-й группы был выше, чем у детей 2-й группы: 8,12 ± 3,6 и 2,50 ± 1,5 соответственно (р < 0,05). Достоверных различий в синтезе ФНО-α, индуцированном ППВ23, выявлено но не было.

При применении вакцины Акт-Хиб были получены аналогичные результаты изменений синтеза цитокинов в обеих группах (см. табл. 2). В 1-й группе значения КС синтеза ИЛ-1β (1,7 ± 0,5) и ИЛ-6 (8,6 ± 4,6) были выше (р < 0,05) по сравнению со значениями во 2-й группе (0,80 ± 0,2 и 1,80 ± 0,6 соответственно). Несмотря на тенденцию к увеличению продукции ФНО-α у детей 1-й группы (1,6 ± 0,4) по сравнению с детьми 2-й группы (1,1 ± 0,1), достоверных различий установить не удалось.

В ходе исследования при оценке факторов адаптивного иммунитета также выявлены различия. Было установлено, что содержание антител IgG к S. рneumoniae в пуповинной крови новорожденных 1-й группы было ниже, чем у детей 2-й группы. Аналогичные результаты были получены и в отношении H. influenzae типа b (табл. 3).

Полученные данные позволили установить, что стимуляция исследованными вакцинами МНК пуповинной крови детей обеих групп оказывала незначительный стимулирующий эффект на уровень экспрессии TLR2 и TLR4 вне зависимости от инфекционного анамнеза. При этом их функциональная активность, оцениваемая по уровню синтеза цитокинов (ИЛ-1β и ИЛ-6), была выше у детей 1-й группы. Это согласуется с данными Ю.Н. Александровой [14], свидетельствующими о повышении уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1α, ИЛ-2, ИЛ-6) у новорожденных с отягощенным инфекционным анамнезом.

Увеличение циркулирующих пулов данных цитокинов, возможно, связано с развитием системной воспалительной реакции в ответ на микробную инвазию [14], что подтверждает их роль в запуске адаптивного иммунного ответа, а также регуляции количества и функциональной активности клеток-эффекторов (нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов). Повышение концентрации ФНО-α в пуповинной крови может служить ранним диагностическим признаком гипоксических изменений в организме новорожденного, что свидетельствует о его участии в патогенезе транзиторных нарушений в раннем периоде адаптации [15].

Выявленные различия показателей врождённого иммунитета в виде дисбаланса в системе провоспалительных цитокинов у детей, рожденных с высоким инфекционным риском, вероятно, имеет важное патогенетическое значение при развитии различных инфекционных заболеваний и определяет особенности развития адаптивного иммунитета. Изменения в гуморальном звене характеризовались достоверно низким уровнем антител IgG к S. рneumoniae и H. influenzae типа b у детей 1-й группы по сравнению с детьми 2-й группы. По-видимому, высокие показатели провоспалительных цитокинов при низком содержании противопневмококковых и противогемофильных антител позволяют сделать предположение о готовности детского организма к развитию воспалительных реакций при антигеном воздействии. Данный признак можно рассматривать как ранний маркер риска развития пневмококковой и гемофильной инфекции у детей с высоким инфекционным риском, что еще раз подтверждает необходимость проведения их ранней вакцинации против этих инфекций.

Выводы

  1. Под воздействием вакцин ППВ23 и Акт-Хиб на МНК пуповинной крови различий по уровню экспрессии TLR2 и TLR4 не выявлено. Функциональная активность МНК, оцениваемая по синтезу провоспалительных цитокинов, была выше у детей 1-й группы.
  2. Низкий уровень противопневмококковых и противогемофильных антител в сочетании с высокой активностью провоспалительных цитокинов может рассматриваться как фактор риска развития пневмококковой и гемофильной инфекций у детей, рожденных с высоким инфекционным риском, что обосновывает необходимость проведения их ранней вакцинации.


Литература



  1. Карханин Н.П., Абдалкин М.Е., Абдалкина Е.Н., Билёв А.Е., Билёва Н.А. Условно-патогенные микробы и «неинфекционные» болезни. Успехи современного естествознания: Материалы IV общероссийской научной конференции «Современные проблемы науки и образования». М., 2009; 2: 40–41.

  2. Анганова Е.В., Чемезова Н.Н., Ермолаева Н.В., Распопина Л.А. Характеристика условно-патогенных возбудителей острых кишечных инфекций. Журн. инфекционной патологии 2010; 17(1): 12–13.

  3. Миронов А.Ю., Харсеева Г.Г., Клюкина Т.В. Основы клинической микробиологии и иммунологии. Ростов-на-Дону: ГОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России, 2011. 248 с.

  4. Костинов М.П., Мещерякова А.К., Фошина Е.П., ТарбаеваД.А., Сависько А.А., Зайцева Е.В. Клиническое течение острой респираторной инфекции и состояние микробиоценоза верхних дыхательных путей у беременных. Журн. микробиол. 2012; 5: 12–16.

  5. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Быкова Л.П. Годовалов Л.П. Анализ структуры и уровня антибиотикорезистентности условно-патогенной микрофлоры нижних дыхательных путей у больных пневмонией. Вестник военно-медицинской академии. Приложение. 2008; 2: 463–464.

  6. Костинов М.П., Лавров В.Ф. Вакцины нового поколения в профилактике инфекционных заболеваний. Изд. 2-е, доп. М.: МВД; 2010. 192 c.

  7. Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Егорова Е. А., Метельская В.А., Гречишникова О.Г., Афанасьев М.С., Рубальский О.В. Роль и биологическое значение Толл-подобных рецепторов в антиинфекционной резистентности организма. Вестник РАМН 2008; 1: 45–54.

  8. Ковальчук Л.В. Исследование экспрессии генов цитокинов в процессе культивирования лейкоцитов здоровых доноров. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2012; 2: 60–63.

  9. Awomoyi A.A., Rallabhandi P., Pollin T.I., Lorenz E., Sztein M.B., Boukhvalova M.S., Hemming V.G., Blanco J.C., Vogel S.N. Association of TLR4 polymorphisms with symptomatic respiratory syncytial virus infection in high-risk infantsand young children. J. Immunol. 2007; 5: 3171–3177.

  10. Blasius A.L., Beutler B. Intracellular toll-like receptors. Immunit. 2010; 32(3): 305–315.

  11. Ганковская О.А., Зверев В.В. Взаимодействие вирусов и Toll-подобных рецепторов. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2010; 2: 101–105.

  12. Ковальчук Л.В., Никонова А.С., Хорева М.В., Юдин А.А., Греченко В.В. Кардиоиммунные взаимодействия на основе рецепторов врожденного иммунитета: состояние вопроса, перспективы развития. Вестник РГМУ 2010; 1: 11–18.

  13. Ястребова Н.Е. Результаты мониторинга антибактериальных и противотканевых антител у здоровых и больных различными заболеваниями людей. Журн. микробиол. 2007; 3: 42–47.

  14. Александрова Ю.Н. Цитокины, IL-1α, IL-2, IL-6, ФНО-α у новорожденных детей различного гестационного возраста с гипоксическим поражением ЦНС и менингитом. Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2011.

  15. Александрова Ю.Н. Роль системы цитокинов в патологии перинатального периода. Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского 2007; 86(1): 116–118.


Об авторах / Для корреспонденции


Для корреспонденции:
Сависько Анна Алексеевна – канд. мед. наук, доц. каф. пропедевтики детских болезней Ростовского государственного медицинского университета Минздрава России
Адрес: 344022, Ростов-на-Дону, ул. Адыгейская, д. 12
Телефон: +7(863) 264-95-31
Е-mail: Annsav@mail.ru

Сведения об авторах:
Костинов Михаил Петрович – д-р мед. наук, проф., заслуженный деятель науки Российской Федерации, руководитель лаб. вакцинопрофилактики и иммунотерапии аллергических заболеваний отд. аллергологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова; vaccinums@gmail.com
Харсеева Галина Георгиевна – д-р мед. наук, проф., зав. каф. микробиологии и вирусологии № 2 Ростовского государственного медицинского университета Минздрава России; galinagh@bk.ru
Ястребова Наталья Евгеньевна – д-р мед. наук, проф., зав. лаб. иммунохимической диагностики отд. иммунологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова; yastreb03@rambler.ru
Шмитько Анна Дмитриевна – аспирантка НИИ вакцин и сывороток РАМН им. И.И. Мечникова; violadellanna@mail.com
Иванова Инна Александровна – канд. биол. наук, зав. лаб. иммунологии особо опасных инфекций Ростовского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора; plague@aaanet.ru
Лабушкина Анна Владимировна – канд. мед. наук, ассистент каф. микробиологии и вирусологии № 2 Ростовского государственного медицинского университета Минздрава России; galinagh@bk.ru


Похожие статьи


Бионика Медиа