Часто болеющие дети являются одной из актуальных проблем современной педиатрии. По определению национальной научно-практической программы «Острые респираторные заболевания (ОРЗ) у детей: лечение и профилактика» (2002), «часто болеющие дети»(ЧБД) – это не диагноз, а группа диспансерного наблюдения, включающая детей с частыми респираторными инфекциями, возникающими из-за транзиторных корригируемых отклонений в защитных системах организма, и не имеющих стойких органических нарушений в них. Повышенная восприимчивость к респираторным инфекциям у ЧБД не связана со стойкими врожденными и наследственными патологическими состояниями». Сегодня, по мнению как отечественных, так и зарубежных авторов, к ЧБД, или детям с рекуррентной респираторной инфекцией, принято относить лиц с частотой ОРЗ от 8 до 12 раз в год [1–3].

В последнее время все больше внимания уделяется герпесвирусным инфекциям (ГВИ), их роли в формировании группы ЧБД и тяжелых форм инфекционных болезней за счет способности к персистенции вирусов в организме, в том числе в иммунокомпетентных клетках [4, 5]. Данные о значении коинфекций как факторов, влияющих на тяжесть основного заболевания, противоречивы. Представители семейства Herpesviridae широко распространены в человеческой популяции. В настоящее время известно 8 герпесвирусов, вызывающих заболевания человека. Большинство герпесвирусов человека (ГВЧ) у здоровых иммунокомпетентных людей находится в латентном состоянии, но при снижении иммунитета под действием различных факторов они могут реактивироваться и вызывать заболевания различной степени тяжести и/или осложнять течение основного заболевания [6]. Многие вопросы, связанные с ролью вируса Эпштейна–Барр (ВЭБ), цитомегаловируса (ЦМВ) и вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6) при инфекционных заболеваниях у детей раннего возраста, остаются недостаточно изученными.

Цель настоящей работы – определение частоты встречаемости маркеров ГВИ у часто и длительно болеющих детей, количественный анализ вирусной нагрузки в клинических материалах и оценка влияния ГВЧ на тяжесть состояния детей.

Материалы и методы

Обследовано 108 детей в возрасте от 1 мес. до 12 лет (средний возраст 2,8 ± 2,5 года), поступивших для лечения в 2011–2013 гг. в Морозовскую детскую городскую клиническую больницу и Инфекционную клиническую больницу № 1 Де­партамента здравоохранения города Москвы с клиническими диагнозами: лимфаденопатия (29), ОРЗ и рецидивирующий обструктивный бронхит (22), инфекционный мононуклеоз (18), пневмония (12), рецидивирующий отит (11), менингит и менингоэнцефалит (9), цитопения (7).

От каждого пациента собирали по 5 мл крови в пробирки, часть образца центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 мин («Joane», Франция) и отбирали плазму для анализа антител (АТ), другую часть использовали для выделения ДНК ГВЧ. Образцы мочи центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 мин и осадок отбирали для дальнейших исследований. Образцы слюны собирали внутри ротовой полости аппликаторами. Все образцы доставляли в день забора в лабораторию и хранили при -70 0С до исследования.

АТ к ЦМВ и к ВЭБ классов IgM и IgG, а также АТ класса IgG к ВГЧ-6 определяли методом ИФА в плазме крови с использованием тест-систем «ВектоЦМВ-IgM», «ВектоЦМВ-IgG», «ВектоВЭБ-VCA-IgM», «ВектоВЭБ-NA-IgG» и «ВектоHHV-6-IgG» («Вектор-Бест», Россия).

ДНК ГВЧ определяли в цельной крови, моче и слюне. Выделение и амплификацию ДНК проводили с помощью наборов фирмы «Интерлабсервис» (Россия). Для выделения ДНК использовали набор реагентов «ДНК-сорб-В». ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили с помощью набора «АмплиСенс® EBV/CMV/HHV6-скрин-FL». Для амплификации использовали термоциклер «iQ iCycler» («BioRad», США). Все процедуры выполняли согласно инструкциям фирмы-производителя.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программы STATISTICA 6,0. Частоту встречаемости ДНК изученных вирусов анализировали с помощью двустороннего точного критерия Фишера и критерия χ2. Для сравнения концентраций ДНК использовали критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ маркеров ГВИ (АТ и/или ДНК) трех ГВЧ (ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-6) у обследованных детей показал, что хотя бы 1 маркер ГВИ в изученных материалах был выявлен у 79 (72,2%) детей, при этом моно- и смешанные ГВИ определялись в группе обследованных с одинаковой частотой – у 38 (35,2%) и 40 (37%) детей соответственно (рис. 1). Моно-ВГЧ-6-инфекция установлена статистически значимо чаще по сравнению с моно-ЦМВ [у 22 (20,3%) и 11 (10,2%) детей соответственно; р = 0,048] и моно-ВЭБ [у 22 (20,3%) и 5 (4,5%) детей соответственно; р = 0,001]. При смешанных инфекциях 2 ГВЧ обнаруживали статистически значимо чаше, чем 3 ГВЧ [у 29 (26,9%) и 11 (10,1%) детей соответственно; р = 0,006].

Интересно было выяснить, какие формы ГВИ характерны для детей, поступивших в стационар с различными инфекционными патологиями. Данные, представленные в табл. 1, показали, что маркеры ЦМВ-инфекции (ЦМВИ) обнаружены у 49,1% детей. Активная стадия выявлена у 26% детей, из них АТ класса IgM определяли в 9,3% наблюдений, только ДНК ЦМВ – в 16,7% наблюдений (см. табл. 1). Латентная инфекция установлена статистически значимо реже (в 7,4% наблюдений; р < 0,05). У 15,7% обследованных детей выявлены маркеры реактивации ЦМВИ. ВЭБ-инфекция (ВЭБИ) установлена у 46,4% детей. Активная форма выявлена у 34,8% детей. Важно отметить, что АТ класса IgM обнаружены у 6 (13,9%) детей, у 5 из них был установлен инфекционный мононуклеоз. Маркеры реактивации хронической формы и латентной ВЭБИ обнаруживали статистически значимо реже по сравнению с активной формой ВЭБИ (9,3 и 2,3% против 34,8% соответственно; р < 0,05). Маркеры ВГЧ-6 инфекции (ВГЧИ-6) выявлены у 57,2% детей. АТ класса IgM к ВГЧ-6 не были изучены, поэтому об активной инфекции, вызванной ВГЧ-6, данные неполные. Реактивация ВГЧИ-6 установлена у 23,9% детей, латентная инфекция в период обследования – у 14,3%. Таким образом, можно заключить, что активная форма ЦМВИ и ВЭБИ, а также реактивация ВЭБИ встречались статистически значимо чаще, чем латентная форма.

Проведено сравнительное изучение частоты встречаемости и вирусной нагрузки ГВЧ в разных клинических материалах. Результаты представлены в табл. 2. Они показали, что ДНК ЦМВ статистически значимо чаще была выявлена в слюне и моче по сравнению с кровью, тогда как ДНК ВЭБ и ВГЧ-6 чаще обнаруживали в слюне и цельной крови и очень редко – в моче.

Использование количественного варианта ПЦР позволило оценить вирусную нагрузку в клинических материалах. Оказалось, что концентрация ДНК ЦМВ и ВЭБ в слюне статистически значимо превышает таковую в цельной крови. Суммарная вирусная нагрузка ВГЧ-6 в клинических образцах (3,4 log10 копий/мл) была ниже, чем при двух других изученных ГВЧ (4,3–4,2 log10 копий/мл; p < 0,05). Важно отметить, что средние значения, характеризующие вирусную нагрузку в образцах цельной крови (3,6–3,7 log10 копий/мл), а также во всех изученных образцах, являются достаточно высокими. Согласно опубликованным данным, при достижении в крови пациентов после пересадки органов концентрации ДНК ЦМВ 2600 копий/мл, что соответствует 3,4 log10 копий/мл, рекомендуется начинать превентивную терапию ЦМВИ [7].

Суммарно ДНК всех изученных ГВЧ по средним значениям статистически значимо чаще определялась в слюне и крови по сравнению с мочой (31,2 и 28,3% против 11% соответственно; р < 0,05).

Анализ частоты клинических диагнозов у обследованных детей (табл. 3) выявил преобладание лимфаденопатии и ОРЗ или рецидивирующего обструктивного бронхита (26,9 и 20,4% соответст­венно). Далее следовали инфекционный мононуклеоз (16,5%), пневмония (11,1%), рецидивирующий отит (10,2%), менингит (8,3%) и цитопении (6,4%). Показано, что без специального возрастного подбора средний возраст детей с поражениями ЦНС был статистически значимо меньше возраста детей в других группах.

В настоящей работе впервые проведен детальный анализ частоты и вирусной нагрузки ГВЧ у ЧБД с различными инфекционными патологиями в зависимости от диагноза. Было показано, что у детей с ОРЗ и рецидивирующим обстуктивным бронхитом статистически значимо чаще выявлены моно-ГВИ по сравнению со смешанными инфекциями [14(63,6%) и 6 (27,3%) случаев соответственно; р = 0,001] (рис. 2). У детей с инфекционным мононуклеозом, наоборот, чаще выявляли смешанную ГВИ [12 (66,7%) случаев против 3 (16,6%); р = 0,001). У 8 (66,7%) из 12 детей обнаружено сочетание ВЭБ + ВГЧ-6, у 3 (25%) – ВЭБ + ЦМВ (р = 0,048). У одного ребенка установлено сочетание трех ГВЧ. Интересно отметить, что ВЭБ при моноинфекции встречался только при инфекционном мононуклеозе и ОРЗ, рецидивирующем обструктивном бронхите. У остальных детей ВЭБ выявлялся только в сочетании с другими ГВЧ.

Результаты анализа вирусной нагрузки в клинических материалах, представленные в табл. 3, показали, что концентрация ДНК всех ГВЧ статистически значимо выше у детей с поражениями ЦНС по сравнению с результатами у детей с ОРЗ и рецидивирующим обструктивным бронхитом. Особого внимания заслуживают данные о том, что в этой группе выявлена высокая вирусная нагрузка ЦМВ (в среднем 6,5 ± 2,4 log10 копий/мл). У детей с лимфаденопатией, инфекционным мононуклеозом и пневмонией концентрация ДНК ЦМВ, а у детей с рецидивирующими отитами – концентрация ДНК ВГЧ-6 были статистически значимо ниже по сравнению с показателями у детей с поражениями ЦНС.

Для принятия решения о проведении этиотропной противовирусной терапии важно оценить количество циркулирующего вируса и определить, при каких значениях вирусной ДНК необходимо начинать превентивную терапию. Согласно опубликованным данным [7, 8], терапию целесообразно начинать при концентрациях ДНК ЦМВ в крови от 2600 (3,4 log10) до 30 000 (4,4 log10) копий/мл в зависимости от риска развития ЦМВИ. По данным D.R. Hardie и соавт. [9], концентрация ДНК ЦМВ > 100 000 (5 log10) копий/мл в цельной крови строго ассоциируется с развитием заболевания.

Важно было оценить частоту встречаемости ДНК ГВЧ в крови, моче и слюне обследованных детей в зависимости от диагноза (табл. 4). Показано, что у детей с ОРЗ и обструктивным бронхитом в крови статистически значимо чаще были обнаружены ДНК ВГЧ-6 и ДНК ВЭБ по сравнению с ДНК ЦМВ (65 и 35% против 10% соответственно; р < 0,05), ДНК ЦМВ, напротив, чаще была обнаружена в моче (35,3 и 0% соответственно; р < 0,05). В крови и слюне у детей с инфекционным мононуклеозом в подавляющем большинстве наблюдений выявлена ДНК ВЭБ, что оказалось статистически значимо чаще по сравнению с ДНК ВГЧ-6 и ЦМВ (в крови – 72,2% против 33,3 и 5,6% соответственно; р < 0,05; в моче – 68,8% против 31,3 и 18,8% соответственно; р < 0,05). У детей с рецидивирующими отитами в крови и слюне ДНК ГВЧ выявлена приблизительно с одинаковой частотой, в моче в 55,6% наблюдений установлена только ДНК ЦМВ. В крови детей с менингитами и менигоэнцефалитами статистически значимо чаще выявлена ДНК ВГЧ-6 по сравнению с ДНК ВЭБ (58,3 и 16,7% соответственно; р = 0,048). В остальных случаях статистически значимых различий не обнаружено.

Среди 108 обследованных детей состояние 24 (22,2%) оценивалось как тяжелое за счет возникших осложнений: у 7 – цитопении (тромбоцитопении и нейтропении), у 8 – плевропневмонии, у 3 – менингоэнцефалита, у 5 – рецидивирующего двустороннего гнойного отита и у 2 – гепатита (ЦМВ- и ЦМВ + ВЭБ-этиологии). Дети были в возрасте от 2 мес. до 10 лет, средний возраст составил 2,5 ± 2,67 года. В 23 (95,8%) случаях в крови выявлена ДНК ГВЧ. У 84 детей заболевание протекало в среднетяжелой и легкой форме. Возраст детей варьировал от 7 мес. до 5 лет и в среднем составил 2,8 ± 2,2 года. ДНК ГВЧ в крови была обнаружена у 50 (59,5%) детей. Различия между двумя группами статистически значимы (ОШ = 15, 95% ДИ [2,1; 329,7]; ОР = 1,6, 95% ДИ [1,2; 1,7]; р = 0,002). Это означает, что присут­ствие ДНК ГВЧ коррелирует с тяжестью заболевания и возникновением осложнений.

Анализ данных о частоте встречаемости и вирусной нагрузке в клинических материалах у детей с тяжелой, среднетяжелой и легкой формой заболевания показал, что в 63 клинических образцах от 24 детей с тяжелой формой заболевания частота встречаемости ЦМВ была статистически значимо выше, чем у детей с легкой формой – 27 (42,8%) образцов против 25 (13,8%) (ОШ = 4,6, 95% ДИ [2,3; 9,5]; ОР = 3,1, 95% ДИ [1,9; 5]; р = 0,005). Такая же закономерность была отмечена при изучении вирусной нагрузки – 4,3 ± 1,6 log10 копий/мл против 3,5 ± 1,2; р = 0,044. ДНК ВЭБ и ДНК ВГЧ-6 у детей с тяжелой формой заболевания встречались реже, чем ДНК ЦМВ, а по уровню вирусной нагрузки и частоте определения не отличались при тяжелом и лег­ком течении болезни. Полученные данные свидетельствуют о том, что тяжесть основного заболевания зависит от высокой вирусной нагрузки ЦМВ, выявленной в клинических образцах у ЧБД, которая составила в среднем 4,3 ± 1,6 log10 копий/мл (19 953 копии/мл). Это указывает на целесообразность детального анализа вирусной нагрузки в каждом конкретном случае, и при значениях, превышающих средние, рассматривать возможность начала специфического противовирусного лечения.

Суммируя результаты настоящей работы, можно заключить:

1. у госпитализированных детей установлена высокая (более 70%) частота обнаружения маркеров ГВИ (ЦМВИ, ВЭБИ, ВГЧИ-6) приблизительно с одинаковой частотой как при моноинфекции, так и при сочетанных ГВИ;
2. активная форма ЦМВИ и ВЭБИ, реактивация ВЭБИ встречались статистически значимо чаще, чем латентная форма этих инфекций;
3. ВГЧ-6 при моноинфекции выявлен статистически значимо чаще по сравнению с остальными ГВЧ;
4. ДНК всех изученных ГВЧ суммарно статистически значимо чаще определялась в слюне и крови по сравнению с мочой, что важно для выбора клинического материала при диагностике;
5. у детей с менингитом и менингоэнцефалитом вирусная нагрузка трех изученных ГВЧ была статистически значимо выше по сравнению с детьми, у которых установлены ОРЗ и рецидивирующий обструктивный бронхит;
6. осложнения основного заболевания в подавляющем большинстве наблюдений ассоциируются с обнаружением ДНК ГВЧ;
7. при тяжелой форме основного заболевания частота и вирусная нагрузка ЦМВ в клинических материалах детей статистически значимо выше, чем при среднетяжелой и легкой формах заболевания.

Результаты исследования показывают, что в план обследования часто и длительно болеющих детей, детей с тяжелой формой болезни необходимо включать определение вирусной нагрузки ГВЧ (ВЭБ, ЦМВ и ВГЧ-6). При подтверждении активной формы инфекции и высоких концентраций ГВЧ можно рекомендовать проведение противовирусной терапии.