Анализ распространенности мутаций лекарственной устойчивости в гене pol ВИЧ-1 среди ВИЧ-инфицированных в Иркутской области


Плотникова Ю.К., Пономарева О.А., Ревизор А.О., Круглова Е.А.

Иркутский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями
Цель исследования. Оценка ситуации по распространению субтипов, рекомбинантных форм, а также резистентных вариантов ВИЧ на территории Иркутской области.
Материалы и методы. Представлены данные анализа нуклеотидных последовательностей гена pol ВИЧ-1, кодирующего ферменты: протеазу, обратную транскриптазу и интегразу. Для исследования была использована плазма крови от 65 ВИЧ-инфицированных лиц, постоянно проживающих в Иркутской области. При помощи коммерческих тест-систем выделяли РНК, проводили реакцию обратной транскрипции, полимеразную цепную реакцию и циклическое секвенирование. Нуклеотидные последовательности детектировали методом капиллярного электрофореза в автоматическом анализаторе молекул.
Результаты. По данным филогенетического анализа, 62 последовательности (95,38%) кластеризовались с вариантом IDU-A субтипа А1 ВИЧ-1, 2 образца группировались с рекомбинантной формой CRF02-AG, 1 образец – с субтипом В. Резистентные к антиретровирусным препаратам штаммы вируса обнаружены у 63% пациентов. Выявлен широкий спектр штаммов с лекарственной устойчивостью: резистентность к ингибиторам протеазы – в 10,77% случаев, к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы – в 58,46%, к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы – в 35,38%, к ингибиторам интегразы – в 3,08%. Доля монорезистентных штаммов составила 34,15%, полирезистентных к двум и более группам препаратов – 65,85%.
Заключение. На территории Иркутской области доминирует субтип А1 ВИЧ-1; выявление других субтипов свидетельствует о возможном усилении миграционной активности населения. Спектр штаммов с лекарст­венной устойчивостью соответствует наиболее часто назначаемым в нашем регионе схемам высокоактивной антиретровирусной терапии.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) отличается значительной генетической вариабельностью, что связано с высокой скоростью размножения, большим размером вирусной популяции в организме инфицированного человека, особенностями работы ферментов, отвечающих за репликацию генома ВИЧ, и рекомбинациями. В связи с этим ВИЧ представляет собой гетерогенную группу, в которой выделяют 2 типа вируса (эпидемически значимый ВИЧ-1 и относительно редкий ВИЧ-2), каждый из которых в свою очередь делится на группы и целый ряд субтипов, циркулирующих (CRF) и уникальных (URF) рекомбинантных форм [1, 2].

Распределение различных субтипов и вариантов в мире неоднородно. В Российской Федерации наибольшее (до 85%) распространение получил тип ВИЧ-1, генетический вариант IDU-А субтипа А1, в меньшей степени – субтип В, рекомбинант CRF03_АВ и некоторые другие [3].

Вопрос генетической вариабельности ВИЧ в последнее время приобретает все большее значение для прак­тической медицины. С внедрением в арсенал диагностических средств новых молекулярно-генетических методов появилась возможность решения ряда прикладных задач. Клиницисты получили инструмент для научно обоснованного назначения и замены схем терапии ВИЧ-инфекции путем выявления мутаций лекарственной устойчивости в геноме вируса [3–5]. Дополнительные горизонты открылись перед эпидемиологами: данные филогенетического анализа первичной структуры геномов применяются при эпидемиологических расследованиях случаев передачи ВИЧ [6, 7]. Анализ циркуляции на определенной территории разных генетических вариантов ВИЧ позволяет устанавливать пути передачи вируса и идентифицировать группы риска, а также прогнозировать динамику эпидемии [8].

На сегодняшний день на территории Иркутской области зарегистрировано более 44 000 человек, инфицированных ВИЧ. Тем временем данные о генетическом разнообразии ВИЧ остаются довольно скудными. В литературных источниках имеются сведения о доминирующем положении в нашем регионе варианта IDU-А субтипа А1 ВИЧ-1, другие субтипы выявлены не были [9]. С 2006 г. началось применение высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ), которая, как мощный эволюционный фактор, должна была привести к появлению в популяции штаммов ВИЧ с мутациями лекарственной устойчивости. Однако долгое время данный вопрос оставался без должного внимания.

Цель исследования – оценка генетического разно­образия ВИЧ на территории Иркутской области и анализ спектра мутаций лекарственной устойчивости.

Материалы и методы

В работе использовали плазму крови от 65 ВИЧ-инфицированных, проживающих на территории Иркутской области, находящихся на диспансерном наблюдении в Иркутском областном центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, на момент исследования получавших лечение антиретровирусными препаратами (АРВП). Применявшиеся схемы ВААРТ приведены в табл. 1. Причинами направления пациентов на определение молекулярно-генетического профиля вируса были признаки вирусологической неэффективности ВААРТ (отсутствие недетектируемой вирусной нагрузки после 6 мес. терапии, «всплески» вирусной нагрузки ВИЧ в процессе терапии после первичного подавления репликации вируса). Полученный клинический материал использовали с информированного согласия пациентов. Вирусная нагрузка в образцах составляла от 1000 до 150 000 копий/мл, по данным определения с применением коммерческих тест-систем Real Time HIV-1 («Abbott», США), Cobas AmpliPrep/TaqMan HIV-1Test («Хоффманн-Ла Рош», Швейцария), РеалБест РНК ВИЧ («Вектор-Бест», Россия) и набора реагентов АмплиСенс® ВИЧ-Монитор-FRT («ИнтерЛабСервис», Россия).

Молекулярно-генетический профиль ВИЧ определяли с помощью коммерческих тест-систем АмплиСенс®HIV-Resist-Seq («ИнтерЛабСервис», Рос­сия) и ViroSeq HIV-1 («Abbott», США), предназначенных для анализа гена pol, кодирующего протеазу, обратную транскриптазу и интегразу. На первом этапе выполняли лизис вируса и очистку препарата с целью получения РНК ВИЧ. Далее проводили реакцию обратной транскрипции для получения комплементарной ДНК, затем полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для накопления изучаемого фрагмента гена pol ВИЧ. С очищенным ПЦР-продуктом проводили реакцию циклического секвенирования с использованием меченых флюоресцентными красителями дидезоксинуклеотидов (ddNTP). После очистки продуктов секвенирования и денатурации их в формамиде проводили процедуру капиллярного электрофореза в полимере POP-7 для детекции нуклеотидной последовательности с помощью автоматического анализатора молекул ДНК ABI PRISM 3500.

Полученные последовательности генома ВИЧ-1 выравнивали в программе Sequencher (version 4.1.4) в соответствии с вариантом ВИЧ-1 HXB2 (регистрационный номер GeneBank K03455). Множественное выравнивание проводили с применением программы BioEdit (version 7.2.5). Для филогенетического анализа использовали метод максимального правдоподобия на основе модели Тамуры–Нэя в программе MEGA 6 [10, 11].

Для анализа мутаций и определения профиля резистентности использовали программу интерпретации мутаций лекарственной устойчивости HIVdb Program: Sequence Analysis (version 7.0, 27.02.2014), представленную на сайте Стэндфордского университета (http://www.hivdb.stanford.edu). Для определения субтипов ВИЧ-1 была выбрана референс-программа COMET HIV-1/2 (version 1.0, 26.03.2014) (http://comet.retrovirology.lu) [12, 13].

Результаты и обсуждение

Анализ фармакорезистентности проводили у пациентов, принимавших АРВП. Мутации лекарственной устойчивости были выявлены в образцах от 41 (63%) пациента. Из них в 58,46% случаев обнаружены мутации лекарственной устойчивости к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (НИОТ), в 35,38% — к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ), в 10,77% — к ингибиторам протеазы (ИП) и в 3,08% случаев — к ингибиторам интегразы (ИИ).

Спектр мутаций лекарственной устойчивости, обнаруженных в исследованных образцах, представлен в табл. 2. Ведущую позицию (58,46%) занимает мутация устойчивости к НИОТ M184V/I в гене обратной транскриптазы ВИЧ-1, значительно снижающая чувствительность к ламивудину и эмтрицитабину. Затем следуют 3 мутации резистентности к ННИОТ (эфавирензу и невирапину) – G190S/A/C (24,14%), K103N/S (15,52%), K101E (15,52%), и одна мутация к НИОТ – L74V/I (18,97%), снижающая чувствительность к нетимидиновым аналогам нуклеозидов (диданозину и, в меньшей степени, абакавиру). В двух образцах выявлены инсерции в позициях: E35 в гене протеазы (не является мутацией резистентности) и T69 в гене обратной транскриптазы (редкая мутация, обусловливающая высокий уровень устойчивости вируса к зидовудину, ставудину, диданозину, абакавиру и тенофовиру).

Такое распределение частот встречаемости мутаций лекарственной устойчивости, по всей видимости, связано с основными схемами терапии, применяемыми в Иркутской области. Относительная редкость встречаемости мутаций устойчивости к ИП связана с высоким генетическим барьером данных препаратов, а к ИИ — с крайней редкостью применения данной группы препаратов в схемах терапии. Высокая распространенность мутаций устойчивости к НИОТ и частое сочетание фармакорезистентности одновременно к НИОТ и ННИОТ связаны с тем, что наиболее активно применялась схема терапии, содержащая 2 НИОТ и 1 ННИОТ, как правило, включающая ламивудин, азидотимидин и эфавиренз (см. табл. 1). Из этих 3 препаратов 2 обладают низким генетическим барьером к формированию лекарственной устойчивости (ламивудин и эфавиренз) [14–16].

В исследованных образцах выявлено 7 различных профилей фармакорезистентности ВИЧ-1 (рис. 1). Мутации лекарственной устойчивости лишь к одной группе препаратов встречались достаточно редко (34,15%). Среди полирезистентных штаммов доминирует комбинация НИОТ + ННИОТ (48,78%), фармакорезистентность сразу к 3 группам препаратов (ИП + НИОТ + ННИОТ) выявлена в 4,88% случаев.

По данным филогенетического анализа участка гена pol (1116 п. н.), кодирующего ферменты протеазу (1–99 кодоны) и обратную транскриптазу (1–273 кодоны), 2 образца (Irk-1 и Irk-2) кластеризовались в 85 построениях из 100 на одной ветви филогенетического древа с ВИЧ-1 рекомбинантной формы CRF02-AG, выделенным на территории Южной Кореи. Образец Irk-37 в 82 построениях из 100 кластеризовался совместно с изолятами вируса субтипа В, выделенными на территории европейской части Российской Федерации, Украины и Китая. Все остальные образцы занимают общую ветвь с изолятами ВИЧ-1 варианта IDU-A субтипа А1, выделенными на территории РФ, Украины, Узбекистана и Казахстана (рис. 2).

Филогенетический анализ фрагмента гена pol (861 п. н.), кодирующего фермент интегразу (1–287 кодоны), показал аналогичные результаты: образцы Irk-1 и Irk-2 отнесены к рекомбинантной форме CRF02-AG, образец Irk-37 — к субтипу В, остальные образцы кластеризуются с ВИЧ-1 варианта IDU-A субтипа А1 (рис. 3).

Изученные последовательности были также про­анализированы с применением on-line программы для генотипирования ВИЧ COMET HIV-1/2. Полученные данные полностью соответствовали результатам филогенетического анализа. Этот факт говорит о достаточности длины полученных последовательностей для генотипирования ВИЧ в данной программе.

Анализ распространенности разных субтипов ВИЧ-1 показал, что на территории Иркутской области доминирует субтип А1 – 95,38%. Выявленные образцы субтипа B и рекомбинантной формы CRF02-AG (1,54 и 3,08% соответственно) ранее не были отмечены в нашем регионе [9]. По-видимому, они представляют собой заносы из других регионов РФ и мира, так как субтип В регулярно выявляется в западных регионах нашей страны, а CRF02-AG преимущественно распространен в странах Западной Африки, Центральной и Юго-Восточной Азии [3, 4].

Таким образом, на территории Иркутской области по-прежнему доминирует вариант IDU-A субтипа А1 ВИЧ-1. В то же время в единичных случаях стали выявляться новые субтипы и циркулирующие рекомбинантные формы – субтипы В и CRF02-AG, ранее не отмечавшиеся в нашем регионе, что скорее всего связано с повышением миграционной активности населения.

Среди пациентов, принимающих АРВП, мутации лекарственной устойчивости выявлены в 63% случаев, причем преобладают мутации к наиболее часто назначавшимся препаратам из групп НИОТ и ННИОТ. Устойчивость к ИП и ИИ отмечается достаточно редко, что связано с высоким генетическим барьером препаратов из группы ИП и ограниченным применением препаратов из группы ИИ. Среди исследованных образцов преобладают полирезистентные штаммы с мутациями лекарственной устойчивости как минимум к двум группам препаратов.


Литература


  1. Hemelaar J. Implications of HIV diversity for the HIV-1 pandemic. Journal of Infections 2013; 66: 391–400.
  2. HIV Sequence Compendium 2015. http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV /COMPENDIUM/2015compendium.html. Дата просмотра 15.09.2015.
  3. Bobkova M. Current status of HIV-1 diversity and drug resistance monitoring in the former USSR. AIDS Rev. 2013; 15: 204–212.
  4. Дементьева Н.Е., Сизова Н.В., Лисицина З.Н., Беляков Н.А. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге. Медицинский академический журнал 2012; 12(2): 97–104.
  5. Лаповок И.А., Лага В.Ю., Васильев А.В., Саламов Г.Г., Казеннова Е.В., Матковский И.А., Мохний Г.А., Мельник Т.А., Бобкова М.Р. Молекулярно-генетический анализ области гена pol, кодирующей интегразу ВИЧ-1, среди пациентов из России и Украины. ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии 2012; 4(2): 73–81.
  6. Bernard E.J., Azad Y., Vandamme A.M., Weait M., Geretti A.M. HIV forensics: pitfalls and acceptable standards in the use of phylogenetic analysis as evidence in criminal investigations of HIV transmission. HIV Medicine 2007; 8: 382–387.
  7. Metzker M.L., Mindell D.P., Liu X.M., Ptak R.G., Gibbs R.A., Hillis D.M. Molecular evidence of HIV-1 transmission in a criminal case. PNAS 2002; 99(22): 14292–14297.
  8. Беляков Н.А., Розенталь В.В., Дементьева Н.Е., Виноградова Т.Н., Сизова Н.В. Моделирование и общие закономерности циркуляции субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ. ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии 2012; 4(2): 7–18.
  9. Лебедев А.В., Казеннова Е.В., Лага В.Ю., Лаповок И.А., Глущенко Н.В., Бобкова М.Р., Плотникова Ю.К., Пономарева О.А., Нешумаев Д.А. Характеристика генетических вариантов ВИЧ-1, выделенных на территории Иркутской области в 2012 году. XXII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 2015; 227.
  10. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution 1993; 10: 512–526.
  11. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 2013; 30: 2725–2729.
  12. Казеннова Е.В., Лаповок И.А., Васильев А.В., Лага В.Ю., Грезина Л.А., Волова Л.Ю., Бобкова М.Р. Проблемы субтипирования ВИЧ-1 на основе анализа гена pol и способы их разрешения. ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии 2010; 2(3): 42–48.
  13. Struck D., Lawyer G., Ternes A., Schmit J., Perez Bercoff D. COMET: adaptive context-based modeling for ultrafast HIV-1 subtype identification. Nucleic Acids Res. 2014; 42(18): 144–155.
  14. Agwu A.L., Bethel J., Hightow-Weidman L.B., Sleasman J.W., Wilson C.M., Rudy B., Kapogiannis B.G. Substantial multiclass transmitted drug resistance and drug-relevant polymorphisms among treatment-naive behaviorally HIV-Infected youth. AIDS Patient Care and STDs 2012; 26(4): 193–196.
  15. Murillo W., Morales S., Paz-Bailey G., Castillo J., Pascale J.M., Albert J., Lorenzana de Rivera I. Transmitted drug resistance among newly diagnosed HIV-1 infected individuals in three Central American countries. 6th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention. July 17–20, 2011, Roma. http://pag.ias2011.org/Abstracts.aspx?AID=. Дата просмотра 18.09.2015.
  16. Taylor S., Allen S., Fidler S., White D., Gibbson S. Stop Study: After discontinuation of efavirenz, plasma concentrations may persist for 2 weeks or longer. 11th Conference on retroviruses and opportunistic infections. February 8, 2004, San Francisco. http://www.retroconference.org/2004/cd/Abstract/131.htm. Дата просмотра 18.09.2015.


Об авторах / Для корреспонденции


Для корреспонденции:
Ревизор Александр Олегович – биолог отд-ния молекулярно-биологических исследований Иркутского областного центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями
Адрес: 664035, Иркутск, ул. Спартаковская, д. 11
Телефон: +7(3952) 77-79-58
E-mail: rao@aids38.ru

Сведения об авторах:
Плотникова Юлия Кимовна – канд. мед. наук, гл. врач Иркутского областного центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями; plot18@ya.ru
Пономарева Ольга Александровна – зав. отд-нием молекулярно-биологических исследований Иркутского областного центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями; poa@aids38.ru
Круглова Екатерина Аркадьевна — врач отд-ния молекулярно-биологических исследований Иркутского областного центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями; atomarnaya@mail.ru


Похожие статьи


Бионика Медиа