Актуальность проблемы инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) определяется особенностями и своеобразием эпидемического процесса, разнообразием этиологической структуры, нозологических форм и клинических проявлений, убиквитарностью указанной группы заболеваний [1, 2].

По данным исследователей CDC (Centers for Disease Control and Prevention, USA) [3], в стационарах США каждый день из 25 госпитализированных 1 пациент заболевает ИСМП. В странах Евросоюза, по данным Европейского центра профилактики и контроля заболеваний (European Centre for Disease Prevention and Control – ECDC) [4], 3,4% всех пациентов хотя бы однократно перенесли ИСМП; ежегодно регистрируется примерно 4 100 000 случаев инфекций данной группы и около 37 000 случаев смерти от ИСМП. В то же время высказывается мнение, что истинные показатели, в частности смертности, как минимум в 3 раза выше [5].

В России в 2014 г. было зарегистрировано 24 308 случаев ИСМП [5], показатели заболеваемости за последние десятилетия неизменно сохраняются на уровне 0,8–0,9 случаев на 1000 пациентов. Однако регистрируемое количество случаев ИСМП не отражает фактической картины, имеет место значительный недоучет числа заболеваний, обусловленных инфекциями данной группы, что в первую очередь связано с несовершенст­вом системы эпидемиологического надзора за ИСМП [6–8], и реальные показатели заболеваемости могут оказаться в 40–50 раз выше данных официальной статистики [9].

Одной из важнейших составляющих системы эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями, в том числе за ИСМП, является микробиологический мониторинг возбудителей инфекции – неотъемлемых составляющих биологического фактора эпидемического процесса. Биологический фактор формирует причину развития эпидемического процесса, и, естественно, без изучения паразитарной системы «паразит–хозяин», без установления роли конкретного «паразита» в конкретной системе невозможно проведение эпидемиологической диагностики случаев ИСМП. В то же время на современном этапе в системе эпидемиологического надзора за ИСМП в конкретных медицинских организациях (МО) не отводится должного места мониторингу возбудителей инфекции. Микробиологические исследования сводятся к поиску условно-патогенной микрофлоры в рамках производст­венного контроля качества дезинфекционных и стерилизационных мероприятий, тогда как целесообразно проводить комплексное обследование пациентов, персонала, окружающей среды с целью возможного обнаружения циркуляции микроорганизмов в условиях конкретной МО в эпидемических цепочках «пациент–объекты окружающей среды» или «пациент–объекты окружающей среды–персонал». Только микроорганизмы, циркулирующие в пределах перечисленных выше эпидемических цепочек в конкретном стационаре, могут считаться принадлежащими к числу возбудителей ИСМП (госпитальных штаммов). Таким образом, необходимо микробиологическое обследование объектов окружающей среды МО как реального резервуара возбудителей ИСМП, обеспечивающего условия для их персистенции как реального локуса формирования госпитальных штаммов. Своеобразие и специфичность возбудителей ИСМП определяется тем, что в результате циркуляции микроорганизмов в МО, в условиях селективного давления антимикробных средств (химиотерапевтических и дезинфицирующих препаратов, антисептиков и т. д.), происходят их естественный отбор и мутация с образованием наиболее устойчивого вида микроорганизма (штамма) с набором определенных свойств, обеспечивающих его вирулентность и способность к персистенции, что является непосредственной причиной инфекции в конкретной МО. Лабильность этиологической структуры данной группы инфекций зависит в наибольшей мере от профиля МО, профиля отделения, географического положения и т. д., однако, согласно данным ECDC, есть определенные тенденции, свойственные Европейскому региону [10].

Наряду с этим необходима оценка широты изучения микробного пейзажа возможных возбудителей ИСМП и целесообразности расширения спектра изучаемых микроорганизмов, циркулирующих в МО. Так, по данным ВОЗ [11], насчитывается более 300 микроорганизмов, потенциально являющихся этиологическими агентами ИСМП, среди которых превалируют (более 90%) возбудители бактериальной природы. Так, в структуре возбудителей ИСМП первое место отводится грамотрицательным бактериям [представителям семейства Enterobacteriaceae (36,19%), неферментирующим грамотрицательным бактериям (15,81%)], которые обусловливают до 2/3 всех зарегистрированных случаев ИСМП. Велика доля грамположительных кокков (32,71%), условно-патогенные и патогенные грибы являются этиологическим фактором в 6,72% случаев (рис.1, см. на вклейке).

Среди представителей семейства Enterobacteriaceae в этиологической структуре ИСМП доминируют: Escherichia coli (51,51%), Klebsiella pneumoniae (22,17%), Proteus mirabilis (10,39%), Enterobacter cloacae (9,14%); из числа неферментирующих грамотрицательных бактерий в качестве возбудителей чаще выделяют Pseudomonas aeruginosa (65,77%), Acinetobacter baumannii (23,14%), Stenotrophomonas maltophilia (7,30%); среди грамположительных кокков преобладают Staphylococcus aureus (44,83%), Enterococcus faecalis (20,16%) [12–15].

Таким образом, микробиологический мониторинг возбудителей ИСМП должен включать выделение микроорганизмов из биотических и абиотических объектов МО, постоянное и наиболее полное изучение информативных фено- и генотипических характеристик циркулирующих микроорганизмов, слежение за их распространенностью в пределах отдельно взятой МО, отдель­ного региона и страны в целом.

Одним из основных фенотипических свойств возбудителей ИСМП, заслуживающих внимания на современном этапе изучения данной группы инфекций, является способность этиологических агентов ИСМП образовывать биопленки на биотических и абиотических объектах.

После создания в 1978 г. теории существования микроорганизмов в окружающей биотической и абиотической среде в двух состояниях (в виде свободных планктонных форм и в замкнутых матрицах-биопленках, в настоящее время считается неоспоримым тот факт, что большинство микроорганизмов существует в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ – биопленок (БП) [16, 17].

Биопленка – термин, обозначающий микробное сообщество, состоящее из клеток, плотно прикрепленных друг к другу или к субстрату любых биосистем, заключенных в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных субстанций, и характеризующееся измененным фенотипом в соответствии с уровнем роста и экспрессией специфичных генов [15]. Фактически любая поверхность как биогенного, так и абиогенного происхождения, колонизирована микроорганизмами, и, следовательно, на всех этих поверхностях, что закономерно, формируются БП. Более того, ни для одного вида бактерий не описано существование только в планктонном состоянии при всех возможных условиях роста. Развитие биопленочных сообществ является одной из стратегий выживания микроорганизмов в окружающей среде, при этом в формировании БП могут принимать участие микроорганизмы одного или нескольких видов, родов и семейств, образуя моно- или мультивидовые сообщества [14, 18]. В составе БП выделяют как активно функционирующие микробные клетки, так и покоящиеся, дормантные (dormant) клетки или клетки-персистеры [19]. Естественно, сформированные БП обладают крайне сложным строением: «Они похожи на города с каналами для поступления питательных веществ и выброса отходов» [20].

Данные многочисленных исследований по всему миру показали, что не менее 80% инфекционной патологии человека обусловлено биопленкообразующими микроорганизмами, в первую очередь условно-патогенными бактериями. Достоверно доказано, что биопленочные сообщества бактерий, мультивидовые БП бактерий и грибов играют основную роль в возникновении и распространении ИСМП, в формировании госпитальных штаммов [21, 22].

Способность бактерий формировать БП рассматривается в настоящее время как один из факторов их вирулентности, при этом разные виды условно-патогенных микроорганизмов обладают различной способностью к образованию БП, и этот фенотипический признак может рассматриваться как фактор вирулентности данного конкретного штамма [13].

Бактерии, образующие БП, проявляют значительно более высокую устойчивость в окружающей среде, в том числе к антимикробным агентам (до 1000 раз по сравнению с планктонными клетками), дезинфекционным средствам, физико-химическим факторам среды, что крайне затрудняет борьбу с возбудителями ИСМП и сводит на нет меры профилактики инфекций [23]. Существуя в форме БП, возбудители ИСМП персистируют в госпитальной среде, являясь резервуаром возбудителей инфекции в течение нескольких недель и даже месяцев.

Микроорганизмы смогли колонизировать боль­шинство биологических ниш на Земле благодаря способности, появившейся миллионы лет назад, образовывать БП, которые можно обнаружить практически на всех субстратах [24]. В норме условно-патогенные представители микробиоты человека образуют БП на кожных покровах, слизистых оболочках, поддерживая тем самым так называемый «микробный гомеостаз» за счет баланса, определяемого множественными межмикробными взаимодействиями, в том числе такими как синергизм и антагонизм [25].

«Заселению» БП могут быть подвержены различные объекты госпитальной среды (поверхности кроватей, прикроватных тумбочек, тележек, стульев, телефонов, кнопок вызова и т. п.; медицинское диагностическое оборудование и приборы), так как известно, что гладкие поверхности колонизируются так же легко, как и шероховатые, а физические особенности поверхности очень незначительно влияют на адгезию микроорганизмов, равно как и наличие влаги на объектах [14, 26, 27]. Наиболее часто в госпитальной среде БП образуют такие микроорганизмы, как Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., B.cepacia, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Campylobacter spp., Helicobacter spp., C. difficile, Candida spp., что обеспечивает их персистенцию в госпитальной среде в течение нескольких недель и даже месяцев [26, 27].

Несмотря на все возрастающее внимание к контролю за очисткой и дезинфекцией объектов окружающей среды в МО, по данным ряда исследователей [26], только 40% поверхностей и объектов удается очистить в достаточной степени, и виной этому является сущест­вование микроорганизмов в госпитальной среде в виде БП [26]. Длительная персистенция госпитальных штаммов в госпитальной среде в форме БП активирует и интенсифицирует пути и факторы передачи возбудителей ИСМП от пациента к пациенту, приводя к возникновению спорадических случаев и вспышек инфекции [27–29].

При эпидемиологическом расследовании случаев ИСМП велика вероятность столкнуться с фактом, что существующие микробиологические методы обнаружения возбудителей, находящихся в окружающей среде в форме БП, могут быть недостаточно эффективными, что в свою очередь может привести к неправильной трактовке полученных результатов исследования, недооценке уровня циркуляции того или иного возбудителя в данной МО, величины контаминации исследованных объектов и поверхностей. Существование микроорганизмов в форме БП, помимо прочего, обеспечивает межвидовой и межродовой горизонтальный перенос генов устойчивости к антимикробным и прочим факторам окружающей среды, формируя новые генотипы возбудителей: БП обеспечивают сохранение субпопуляции дормантных форм (клеток-персисторов) микроорганизмов, составляющих 0,1–10% всей популяции БП [19, 27].

До настоящего времени окончательно не установлена роль тех или иных структур БП в обеспечении устойчивости микроорганизмов к антибиотическим веществам и стрессовым факторам среды. Некоторые авторы предполагают важную роль компонентов матрикса биопленок, однако экспериментальные доказательства механизма этого явления отсутствуют, поэтому механизмы, а также роль в этих процессах внеклеточного полимерного матрикса БП заслуживают более детального изучения для понимания условий и закономерностей процессов формирования госпитальных штаммов [30].

Экзополисахаридный матрикс (ЭПС-матрикс) – продукт жизнедеятельности микробных клеток, входящих в состав БП. Это основной, ключевой структурный компонент БП, тогда как сами микроорганизмы составляют лишь 5–35% массы БП. Итак, каждый процесс формирования БП завершается образованием ЭПС-матрикса, представляющего собой многокомпонентную систему, включающую экзополисахариды, белки, нуклеиновые кислоты, фосфолипиды и прочие вещества, аналогичные по составу клеточным стенкам микроорганизмов. Свойства ЭПС-матрикса определяют взаимоотношения биопленочного сообщества с внешней средой, в ряде случаев ЭПС-матрикс выполняет функцию депо питательных веществ, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов, его продуцирующих [31, 32].

Экзополисахариды (ЭПС) часто называют адгезивными полимерами, так как они ответственны за инициацию формирования БП на субстратах (первичная адгезия, неспецифическая адгезия) [32, 33]. Стоит отметить, что содержание ЭПС по меньшей мере в 5 раз выше, чем белков и составляет порядка 85% от общего объема БП. Считается, что ЭПС могут способствовать предварительной подготовке поверхности к прикреплению микробных клеток. X. Chen и P.S. Stewart в 2002 г. выдвинули гипотезу о том, что ЭПС ответственны не только за адгезию к поверхности, но и за структуру матрикса, за его прочность и целостность, а S. Tsuneda и соавт. обнаружили корреляцию между производством ЭПС и архитектурой биопленки [14, 15].

Таким образом, ЭПС представляют собой строительный материал БП, попросту говоря, «кирпичи». Однако помимо этого ЭПС выполняет функцию первичной адгезии к поверхности, являются депо воды.

Белки ЭПС-матрикса – один из основных факторов, влияющих на процесс формирования БП. Они инициируют фазу специфической адгезии микроорганизмов (фазу необратимого связывания) [34] и принимают непосредственное участие в прикреплении к субстрату [35]. На первом этапе эти макромолекулы накапливаются на поверхности клетки, далее секретируются во внешнюю среду и адсорбируются на субстрат, прикрепляясь к нему [36]. Белковый слой, сформированный на поверхности, способствует бактериальному спаечному процессу. Слой адгезированных белков может преобразоваться из твердого в гелеобразное состояние в случае необходимости специфического взаимодействия с другими веществами бактерий [37]. На более поздних этапах прикрепления также наблюдается секреция белковых компонентов, что в результате приводит к усилению адгезии бактериальных клеток к субстрату [38]. Следовательно, способность микроорганизмов к биосинтезу внеклеточных белков играет важнейшую роль в процессе микробной колонизации [39].

Таким образом, белки ЭПС-матрикса можно представить как «цемент», скрепляющие вещества, инициаторы необратимого связывания микроколонии с субстратом. Но это, как и следовало ожидать, не единственная функция данного компонента. Белки – это регуляторы синтеза и транспорта ЭПС (как в мембране клеток), внеклеточной ДНК (вДНК), а также являются своеобразными органеллами движения.

Наряду с вышеописанными белками к компонентам матрикса можно отнести пили, фимбрии и скрученности (curli), которые представляют собой белковые органеллы, встречающиеся преимущественно у грамотрицательных бактерий, которые обеспечивают процесс адгезии и прилипания (attachment), подвижность бактерий, формирование БП, транспорт экзопродуктов через мембраны во внешнюю среду [40].

Фосфолипиды (ФЛ) как компонент БП входят в состав поверхностной оболочки, формируя мембраноподобную структуру на границе с внешней средой. Предполагают, что данная оболочка, в связи с ее гидрофобными свойствами, может служить преградой для попадания антимикробных средств в БП [41].

Состав ФЛ поверхностной оболочки схож с ФЛ мембран клеточной стенки бактерий, составляющих БП, однако обращает на себя внимание, что различия между мембранными ФЛ и ФЛ матрикса касаются стабильных и нестабильных фракций. Так, мембраны всех бактерий по сравнению с матриксом содержат значительно больше нестабильных лизофосфолипидов, в то же время матрикс несет в себе больше стабильного кардиолипина. Повышенное содержание кардиолипина в ФЛ внеклеточного пространства БП, по-видимому, является предпосылкой образования мембраноподобной структуры повышенной прочности, функционирующей в качестве защитного барьера [42]. Можно заключить, что ФЛ – один из физических барьеров БП, позволяющий препятствовать проникновению гидрофильных веществ в каналы матрикса, а также затрудняющий процесс испарения влаги с поверхности БП.

Наиболее важным, на наш взгляд, структурным компонентом ЭПС-матрикса являются нуклеиновые кислоты, в частности, вДНК. Существует мнение, что этот компонент происходит из хромосомной ДНК и появляется в матриксе БП при аутолизе микробных клеток и путем везикулярной секреции из живой микробной клетки. В то же время есть мнение, что появлению вДНК не предшедствует лизис клеток, так как максимальная концентрация этого компонента матрикса наблюдается на стадиях активного формирования первичной структуры БП.

Структура вДНК представлена в матриксе в виде длинных (yarn structures) (рис. 2, см. на вклейке) и коротких (sweater structure) (рис. 3, см. на вклейке) компонентов [43].

Данные последних исследований [44–47] показали, что вДНК принимает участие в формировании БП на различных стадиях, в том числе на начальном этапе бактериальной адгезии и агрегации, организует архитектуру БП и ее функциональную стабилизацию. Нити вДНК с помощью кислотно-основных связей образуют прочные соединения между полисахаридами и белками, входящими в состав формирующегося матрикса, тем самым образовывая высокоорганизованную прочную структуру БП, в том числе обеспечивая связи между мембранами микробных клеток и полисахаридами [48, 49]. Увеличение количества вДНК в составе БП интенсифицирует рост и укрепляет БП более чем на 200% по сравнению с исходными значениями. Согласно данным T. Das и соавт. [49], наличие внеклеточной ДНК в матрице БП, в частности Streptococcus mutans, связано с экспортом большого количества сигнальных пептидов в среду БП. Также показано, что вДНК фактически обеспечивает горизонтальный перенос генов в зрелой структуре БП, что, в свою очередь, определяет антибиотикоустойчивость микроорганизмов в составе БП [50]. Наличие вДНК в матриксе является одним из наиболее вероятных признаков высокой резистентности бактерий, составляющих БП, к повреждающим факторам среды [51].

Иными словами, вДНК – это банк данных, регулирующих деятельность микроорганизмов в составе БП, позволяющий им оперативно реализовывать тактические задачи преодоления того или иного стрессорного фактора. Предполагается что, роль вДНК в процессе формирования и функционирования БП различными микроорганизмами сходна с ролью системы регуляции Quorum Sensing, и это, вероятно, является своеобразным «интернетом» для бактерий.

вДНК является наиболее целесообразной мишенью для разработки эффективных мер по преодолению свойства биопленкообразования у госпитальных штаммов.

Подводя итог, можно с уверенностью заключить, что способность к интенсивному биопленкообразованию на биотических и абиотических объектах является одним из основных проявлений адаптационных механизмов возбудителей ИСМП, позволяющих им выживать и персистировать в условиях агрессивной (для микроорганизмов) среды МО, которая непрерывно меняется и совершенст­вуется, исходя из потребностей микроорганизмов, ее создающих.

Таким образом, понимание закономерностей образования БП позволит найти путь к раскрытию механизмов формирования госпитальных штаммов микроорганизмов, что послужит совершенствованию системы эпидемиологического надзора за ИСМП.

На современном этапе методы изучения биопленкообразующей способности микроорганизмов характеризуются разнообразием и зачастую субъективностью оценки и интерпретации, что затрудняет сравнение результатов исследований интенсивности экспрессии данного признака у различных видов и штаммов микроорганизмов в лабораторных условиях, оценку уровня антибиопленочной активности химических соединений и физических факторов, условий формирования полирезистентных штаммов возбудителей ИСМП [52, 53].

В целях совершенствования микробиологической диагностики и системы мониторинга биологических свойств возбудителей ИСМП, являющихся важнейшими компонентами системы эпидемиологического надзора, необходимо:

• разработать оптимальные методики индикации возбудителей ИСМП, существующих на объектах госпитальной среды в виде БП;
• унифицировать модели изучения фенотипического свойства биопленкообразования у возбудителей ИСМП различной этиологии in vitro для оценки влияния стрессовых факторов среды на биопленочные сообщества микроорганизмов с целью разработки оптимальной системы мер для преодоления данного свойства;
• разработать подходы к созданию тест-систем по качественной и количественной оценке вДНК в матриксе БП, образованных госпитальными штаммами. Результаты исследований позволят выявлять маркеры вирулентности госпитальных штаммов по признаку эспрессивности биопленкообразования, что предоставит возможность оперативно оценить устойчивость госпитального штамма во внешней среде, выявить возможную полирезистентность циркулирующего штамма к действию антибиотических веществ с последующим прогнозированием эпидемической ситуации по ИСМП в конкретной МО.

Все вышеперечисленное послужит решению задач Национальной концепции профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи от 6 ноября 2011 г., утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, и позволит усовершенствовать систему эпидемиологического надзора за ИСМП.