В последние годы наблюдается значительное снижение интенсивности эпидемического процесса гепатита А (ГА) на территории Российской Федерации. С 2001 по 2010 г. показатель заболеваемости ГА снизился более чем в 12 раз (с 79,5 до 6,5 на 100 тыс. населения). Однако существующую эпидемическую ситуацию нельзя назвать стабильной, поскольку увеличивается число лиц, восприимчивых к данной инфекции [1, 2], остается неудовлетворительным уровень санитарно-коммунального благополучия многих территорий страны, продолжается миграция населения из эндемичных по ГА стран [3].

Анализ заболеваемости ГА в Москве в период с 2001 по 2010 г. также демонстрирует выраженную тенденцию к снижению. При этом показатель заболеваемости ГА до 2009 г. ни разу не превысил общероссийский. Однако в 2010 г. в Москве произошел резкий рост числа зарегистрированных случаев ГА (1156), что обусловило почти двукратное увеличение показателя заболеваемости по сравнению с предыдущим годом (10,97 на 100 тыс. населения в 2010 г. и 5,93 – в 2009 г.) и превышение в 1,7 раза показателя заболеваемости по стране в целом (рис. 1).

Основной причиной роста заболеваемости стало возникновение трех вспышек ГА, в которых пострадал 841 человек, что составило 72,8% от общего числа заболевших в 2010 г. Крупная вспышка произошла с 25 декабря 2009 г. по 15 марта 2010 г., в которой пострадали 828 человек, в том числе 61 (7,4%) житель Московской области. Среди заболевших было 67 (8,1%) детей до 17 лет. В ходе эпидемиологического расследования с факторным опросом заболевших было установлено, что значительная часть из них употребляла готовые салаты, приобретенные в магазинах одной из крупных торговых сетей, имеющей на территории Подмосковья собственный цех по производству салатной продукции.

Ранее при расследовании вспышек ГА традиционно использовали методы лабораторной диагностики, направленные на выявление анти-HAV IgМ в образцах сыворотки крови больных и контактных лиц и антигена вируса гепатита А (ВГА) в образцах объектов окружающей среды. Развитие молекулярно-биологических методов в последние десятилетия позволило значительно расширить представления о ВГА, его характеристиках и свойствах. В 1987 г. была определена полная нуклеотидная последовательность генома вируса [4], в 1992 г. предложена первая классификация генотипов [5]. В настоящее время выделяют 6 генотипов ВГА (I–VI), при этом наиболее распространенными в мире являются генотипы IA и IIIA [6, 7]. Разработка молекулярно-биологических методов детекции и генотипирования возбудителей инфекционных болезней привела к их широкому внедрению как в клиническую практику, так и в работу специалистов, осуществляющих эпидемиологический надзор, в том числе для расследовании вспышек ГА [8, 9].

Цель настоящей работы – оценка возможностей молекулярно-биологических методов при расследовании вспышек ГА в условиях крупного мегаполиса.

Материалы и методы

В исследование было включено 189 образцов сыворотки крови больных ГА, 65 образцов салатной продукции и продовольственного сырья, 12 образцов элюатов водных проб и 8 образцов проб питьевой воды по 20 л, отобранных до проведения дезинфекционных мероприятий из распределительной водопроводной сети цеха по производству салатной продукции и скважин, расположенных на прилегающей к цеху территории.

Для оценки микробиологических показателей (общее микробное число, термотолерантные колиформные бактерии, колифаги, споры сульфитредуцирующих клостридий) исследовано 500 мл из каждой пробы воды. Для молекулярно-биологического исследования каждый образец воды был сконцентрирован на фильтровальном модуле с мембранами с усиленным положительным зарядом (до 40 мВ/см²). РНК ВГА выделяли из 100 мкл образца сыворотки крови с помощью автоматической станции для выделения нуклеиновых кислот «NucliSENS® easyMAGTM» («bioMerieux», Франция). РНК ВГА, энтеровирусов, ротавирусов, астровирусов и норовирусов выделяли из 1000 мкл образцов концентратов и элюатов водных проб и смывов с образцов салатной продукции и продовольственного сырья с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб» (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Выявление РНК ВГА, энтеровирусов, ротавирусов, норовирусов и астровирусов проводили с использованием комплектов реагентов «АмплиСенс® HAV-FL» [10], «АмплиСенс® Enterovirus», «АмплиСенс® Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FL» соответственно. Все вышеуказанные комплекты реагентов и реагенты, используемые для проведения ПЦР и обратной транскрипции, производства ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Субтипирование ВГА проводили методом ПЦР с субтипспецифичными праймерами. Для определения штаммов проводили секвенирование двух вариабельных фрагментов генома ВГА: VP1/2B длиной 410 н.п. и 2С длиной 648 н.п. Реакцию циклического секвенирования и последующую очистку продуктов реакции осуществляли с использованием реактивов для секвенирования производства «Applied Biоsystems» (США). Флюоресцентное секвенирование производили с использованием автоматического секвенатора 3100 Genetic Analyzer («Applied Biоsystems»). Филогенетический анализ штаммов осуществлялся методом Minimum Evolution (MEGA 4.1), статистическую значимость филогенетических кластеров оценивали методом Interior-branch test (1000 повторов). Изоляты, идентичные в пределах двух секвенированных областей, принимали за один штамм. Штаммы, отличающиеся друг от друга не более чем на две нуклеотидные замены в пределах двух секвенированных областей, относили к генетически близкородственным штаммам.

Результаты и обсуждение

Среди всех образцов сыворотки крови 170 (89,9%) содержали РНК ВГА. Генотип ВГА был определен для 167 изолятов вируса, 155 (92,8%) из которых относились к субтипу IA и 12 (7,2%) – к субтипу IIIA.

Секвенирование вариабельных областей генома ВГА проведено для 151 изолята. Большинство изолятов (129; 85,4%) было представлено идентичным штаммом субтипа IA ВГА (U97MSK AVP1), что позволяет сделать вывод о едином источнике заражения и является доказательством того, что данный штамм стал причиной вспышки. Анализ доминирующего штамма в пределах VP1/2B области генома показал его высокое генетическое сходство со штаммом Moscow-2001 A2K54 (AY226602) из базы данных нуклеотидных последовательностей GenBank, выявленным в Москве в 2001 г.

Филогенетический анализ показал, что доминирующий штамм относится к кластеру типичных для Европейской части РФ штаммов ВГА, однако значимо отличается от штаммов субтипа IA, выявленных при расследовании вспышек на территории РФ в течение предшествующих 5 лет (рис. 2). Так, вспышки ВГА в Нижнем Новгороде (2005 г.), Тверской обл. (2005 г.) и Рязанской обл. (2009 г.) были вызваны штаммами субтипа IA, образующими общий кластер, отличный от кластера штаммов московской вспышки. Вспышка ГА в Махачкале (2008 г.) была вызвана несколькими близкородственными штаммами ВГА, типичными для южных регионов европейской части РФ и Украины. Во время вспышек ГА в Республике Тыва в 2008 и 2010 гг. выявлялись штаммы субтипа IA вируса, уникальные для этого региона и образующие на филогенетическом дереве отдельный кластер. Для вспышки ГА в Сахалинской обл. (2006 г.) были характерны штаммы вируса, филогенетически близкие штаммам, выявлявшимся ранее в Средиземноморском регионе [11].

Рисунок 2.

В период вспышки в Москве также были выявлены 5 штаммов, генетически близкородственных доминирующему штамму, которые образовывали с ним на филогенетическом дереве единый кластер, что может свидетельствовать об их эпидемиологической связи со вспышкой (см. рис. 2).

Кроме того, во время вспышки было выявлено 3 штамма субтипа IA, которые не кластеризовались с доминирующим штаммом, что позволяет сделать вывод об отсутствии связи данных штаммов со вспышкой. Один из этих штаммов (U60Z13), который был выявлен в 6 образцах сыворотки крови, неоднократно выявлялся в нескольких регионах европейской части России: во время вспышки ГА в Тверской обл. в 2005 г., в Новгородской обл. и в образце воды из Москвы-реки в 2007 г., а также стал причиной вспышки ГА в пос. Костино Рыбновского района Рязанской обл. в октябре 2009 г. Это позволяет считать данный штамм эндемичным для территории Европейской части РФ. Два других штамма не кластеризовались с типичными для Европейской части РФ штаммами, но попадали в филогенетический кластер штаммов, встречающихся на территории стран СНГ. Случаи заболевания, вызванные данными штаммами, вероятнее всего, являются завозными из республик Средней Азии, так как близкие штаммы вируса ранее выявлялись в Таджикистане и Узбекистане. Значительные генетические отличия этих штаммов от доминирующего исключают их эпидемиологическую связь со вспышкой. Случаи ГА, вызванные данными штаммами, являются спорадическими, выявленными на фоне вспышечной заболеваемости.

В 12 исследованных образцах были выявлены штаммы субтипа IIIA ВГА, что однозначно исключает эпидемиологическую связь данных штаммов со вспышкой. Штаммы, выявленные в 11 образцах, значительно отличаются от штаммов, характерных для Европейской части РФ, и попадают в кластер штаммов субтипа IIIA, типичных для республик Средней Азии, что говорит о завозном характере данных случаев заболевания (рис. 3).

Рисунок 3.

Особый интерес представляет тот факт, что среди выявленных штаммов субтипа IIIA был обнаружен идентичный штамм (U99 AVP1) в образцах сыворотки крови от трех заболевших педагогов одной из школ Москвы. Среди других сотрудников и учащихся данного образовательного учреждения в ходе эпидемиологического расследования были выявлены еще 7 случаев ГА. Таким образом, применение молекулярно-биологических методов позволило выявить эпидемический очаг ГА в образовательном учреждении, который не имел отношения к вспышке ГА в Москве, возникшей в тот же период. Остальные 8 выявленных штаммов вируса, попадающих в тот же филогенетический кластер, были уникальными для каждого образца. Случаи заболевания, вызванные данными штаммами, вероятнее всего, не имеют эпидемиологической связи, а являются отдельными случаями ГА, завезенными из республик Средней Азии. Один из случаев был вызван штаммом субтипа IIIA (msk10119 AVP1), выявлявшимся ранее в Республике Саха, и нехарактерен для Средней Азии.

В образцах концентратов и элюатов водных проб и в смывах с образцов салатной продукции и продовольственного сырья РНК ВГА, энтеровирусов, ротавирусов, астровирусов и норовирусов не обнаружена. Результаты микробиологического исследования образцов воды по всем тестируемым показателям также были отрицательными, что свидетельствует об отсутствии фекального загрязнения анализируемых образцов.

Таким образом, в результате проведенного исследования был выявлен штамм, вызвавший вспышку ГА в Москве, и генетически близкородственные ему штаммы, а также штаммы, которые не имели эпидемиологической связи со вспышкой.

Молекулярно-биологические методы в настоящее время широко используются в практике эпидемиологических расследований, в том числе при расследовании вспышек энтеральных вирусных гепатитов. Среди молекулярных методов при расследовании вспышек ГА наиболее широко применяемыми и информативными являются методы, основанные на ПЦР, секвенировании нуклеиновых кислот с последующим филогенетическим анализом. Комплексный анализ данных, полученных на разных этапах расследования с применением молекулярно-биологических методов, и данных классического эпидемиологического расследования позволяет сократить сроки расследования, более точно идентифицировать этиологический агент и источники инфекции и с высокой степенью надежности установить или опровергнуть факт связи отдельных случаев инфекции между собой, а также с выявленными источниками и выявить завозные случаи инфекции.