С развитием молекулярно-генетических методов и появлением возможности определять генетические характеристики возбудителей инфекционных болезней было положено начало новому направлению эпидемиологических исследований. Использование молекулярно-генетических методов позволяет идентифицировать возбудителя инфекции, более эффективно устанавливать связь между случаями инфицирования, определять факторы передачи возбудителя, проводить мониторинг географического распространения генетических вариантов возбудителя, выявлять генетические маркеры факторов вирулентности и идентифицировать факторы риска.

Вирусные гепатиты до настоящего времени остаются значимой проблемой здравоохранения как в России, так и в мире. По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется около 1,5 млн случаев гепатита А [1], а общее число заболевших может составлять десятки миллионов в год [2]. Число больных хроническими формами гепатита В в мире оценивается в 240 млн человек и около 600 тыс. человек в год умирают от острых форм инфекции и исходов хронического гепатита В [3]. В России в течение последних лет наблюдается неуклонное снижение заболеваемости гепатитом А, однако в 2012 г. ее показатель оставался достаточно высоким – 5,5 на 100 тыс. населения. Заболеваемость хроническими формами инфекции, вызванной вирусом гепатита В (ВГВ), в 2012 г. составляла 33,7 случаев на 100 тыс. населения и в 23,7 раза превышала заболеваемость острым гепатитом В. В настоящей статье на примере гепатитов А и В раскрываются современные возможности и перспективы использования молекулярно-генетических подходов к изучению эпидемического процесса вирусных гепатитов.

Генетическое разнообразие вируса гепатита А и его эпидемиологическое значение

На основе гомологии нуклеотидных последовательностей региона VP1/2A генома вируса гепатита А (ВГА) было выделено 6 его генотипов (I–VI) [4]. Генотипы I и II были изолированы только от больных людей, генотипы IV–VI – только от обезьян, генотип III был выявлен как у человека, так и у приматов. Каждый из генотипов I, II и III подразделяется на 2 субтипа – A и B. Наиболее распространенными в мире является субтипы IA и IIIA.

Особенности циркуляции генетических вариантов ВГА на различных территориях изучались в ряде работ. В исследовании, положившем начало генетической классификации ВГА, было показано, что в пределах субтипа IА существует филогенетическое родство изолятов, циркулирующих в одном географическом регионе. Были выявлены кластеры изолятов из Японии и Китая, с территории бывшего СССР и Таиланда [4]. О.V. Nainan и соавт. [5] проанализировали более 3500 изолятов ВГА из США и других стран мира и доказали наличие географической кластеризации штаммов ВГА.

Нами были изучены генетические характеристики 1071 изолята ВГА из 30 регионов РФ, входящих в состав всех восьми федеральных округов (ФО), а также ряда стран СНГ. В результате исследования было установлено, что большинство (73%) изолятов ВГА из РФ относятся к субтипу IA, а оставшиеся 27% принадлежат субтипу IIIA. Случаи гепатита А, вызванные субтипом IB, в РФ единичны и, за редким исключением, являются завозными [6].

Во всех ФО доминирующим субтипом ВГА является субтип IA, доля которого составляет от 62% (Дальневосточный ФО) до 94% (Уральский ФО). В ряде регионов значительное место среди выявленных изолятов ВГА занимает субтип IIIA. Так, более четверти всех случаев гепатита А было вызвано данным субтипом вируса в Центральном (30%) и Дальневосточном ФО (38%) (рис. 1, см. на вклейке). Наибольшая доля (62%) субтипа IIIA была выявлена в Республике Саха.

В странах Средней Азии (Таджикистан, Кыр­гызстан) доминирующим является субтип IIIA ВГА, который составляет более 70% всех случаев. В Украине доминирующим субтипом ВГА является субтип IA, доля которого превышает 85%.

При филогенетическом анализе изолятов ВГА субтипа IA из России и стран СНГ было выявлено, что большинство из них статистически достоверно группируются в 2 отдельных кластера, отличных от средиземноморского, американских и азиатско-тихоокеанских. Выявленные особенности кластеризации штаммов ВГА субтипа IА, циркулирующего в РФ, странах СНГ и других странах мира, доказывают возможность использования филогенетического анализа для подтверждения фактов завозных случаев гепатита А из стран дальнего зарубежья.

В пределах крупных географических кластеров филогенетически родственных штаммов ВГА субтипа IA часто можно выделить подкластеры штаммов, циркулирующих на отдельных ограниченных территориях. Так, для юга Таиланда было показано существование характерных для данной территории штаммов ВГА, выявленных на протяжении 4 лет наблюдения [7]. Изоляты ВГА, циркулирующие на территории центрального и южного районов Туниса на протяжении 2001–2004 гг., формируют на филогенетическом дереве соответствующие кластеры родственных штаммов [8].

Интересные данные были получены по филогеографии ВГА в Южной Америке. В работе M. Costa-Mattioli и соавт. [9] было показано, что изоляты ВГА IA, циркулирующие на территории Аргентины, Уругвая и Чили, обладают высокой генетической вариабельностью, и кластеризация штаммов на дереве по географическому признаку не обнаруживается. В последующем детальном исследовании ВГА в Аргентине было показано, что штаммы из этой страны образуют 2 статистически значимых кластера, при этом географически штаммы перемешаны – на одной территории встречаются штаммы из обоих кластеров [10]. Интересно, что штаммы только одного из этих кластеров группируются с референс-штаммами из Италии, Туниса и США.

Иная картина наблюдается с разнообразием штаммов ВГА на территории Амазонии (Бразилия), где инфицирование гепатитом А происходит, в основном, в детском возрасте, а заболеваемость взрослого населения исключительно низка. В работе V.S. De Paula и соавт. [11] было установлено, что большинство штаммов ВГА, циркулирующих на территории Амазонии, группируется в отдельный кластер и имеет филогенетическое сходство со штаммами, циркулирующими на других территориях Бразилии.

Многолетняя циркуляция штаммов ВГА на одной территории также была показана для развитых стран – Италии [12], Японии [13] и США [5]. Штаммы, циркулирующие на территории США, группируются на дереве в 3 различных кластера. Один из этих кластеров включает штаммы, циркулирующие на территории соседней Мексики. При этом на территории США штаммы из этой группы преимущественно встречались у выезжавших в Мексику либо у контактировавших с приезжими из этой страны и вызывали пищевые вспышки, связанные с употреблением зеленого лука, импортируемого из Мексики [14].

Детальный анализ филогенетических взаимоотношений штаммов субтипа IA, выявленных в РФ и странах СНГ, показал, что можно выделить ряд статистически достоверных кластеров, соответствующих отдельным географическим регионам. Единый кластер формируют изоляты ВГА, выявлявшиеся у больных гепатитом А, из регионов Европейской части РФ. Два кластера соответствуют изолятам ВГА, выявленным на территории Южного и Северо-Кавказского ФО и в Украине. Большинство изолятов IA субтипа, выявленных в Таджикистане и Кыргызстане, группируются также в два кластера. Отдельную ветвь на филогенетическом дереве формируют изоляты, циркулирующие в Республике Тыва. Изоляты ВГА субтипа IA, выявленные в Сахалинской области и Хабаровском крае, также формируют отдельный кластер. Таким образом, анализ позволил выявить 7 кластеров ВГА субтипа IA, характерных для регионов России и стран СНГ: кластер Европейской части РФ, 2 южных кластера, 2 среднеазиатских кластера, тувинский кластер и дальневосточный кластер (рис. 2, см. на вклейке).

Необходимо отметить, что штаммы кластера Европейской части РФ являются наиболее распространенными на территории РФ и вызывают большинство вспышек гепатита А. Штаммы тувинского кластера субтипа IA были обнаружены только в данном регионе, что, вероятно, связано с особенностями его географического и социально-экономического положения. Штаммы, формирующие дальневосточный кластер, филогенетически близки к средиземноморским штаммам, выявлявшимся в Тунисе, Италии и Испании. Анализ генетического разнообразия штаммов ВГА в Сахалинской области и Хабаровском крае на протяжении 2006–2007 гг. показал, что генетические варианты, формирующие дальневосточный кластер, циркулируют на данной территории на протяжении длительного времени и не являются генетически идентичными. Это свидетельствует о длительной эволюции описанных штаммов ВГА на данной территории, и случаи гепатита А, ими вызванные, не могут считаться завозными. Филогенетический анализ штаммов III генотипа ВГА выявил наличие трех кластеров для штаммов субтипа IIIA, один из которых (основной кластер) содержал абсолютное большинство российских штаммов и штаммов стран СНГ. Абсолютное большинство штаммов из стран Средней Азии, выявленных в данной работе, образовывали единый кластер. Штаммы субтипа IIIA, обнаруженные на территории Республики Саха (Якутия), образовывали целую группу кластеров, филогенетически отличных от среднеазиатских. Отдельным кластером, достоверно отличающимся от других, были представлены штаммы, выявленные в Кемеровской области [15].

Таким образом, филогенетический анализ штаммов ВГА субтипов IA и IIIA, циркулирующих в РФ, Украине, Таджикистане и Кыргызстане, позволил выявить ряд географических кластеров, характерных для стран Средней Азии и отдельных регионов РФ. Это демонстрирует возможность использования данного подхода при эпидемиологической диагностике не только для установления факта завоза случаев гепатита А из стран дальнего зарубежья, но и для выявления завозных случаев заболевания из отдельных регионов РФ и стран СНГ.

ВГА является одним из самых стабильных РНК-содержащих вирусов. Скорость его генетической эволюции составляет 9,76 x 10-4 нуклеотидных замен на сайт в год [16]. Скорость эволюции в синонимичных позициях кодона составляет 1,3–4,0 x 10-3, что на порядок ниже, чем оценки для других членов семейства Picornaviridae [16, 17].

Следствием относительно небольшой скорости эволюции вируса является генетическая однородность вирусной популяции, выявляемой у пациентов во время вспышек гепатита А. Изоляты, выделенные во время вспышек и охарактеризованные по наиболее вариабельным фрагментам генома, обычно относятся к одному штамму (генетически идентичны у всех пациентов по маркерным последовательностям генома) [18]. Во время вспышек с установленным источником инфицирования изоляты ВГА, выделенные от пациентов, идентичны между собой и идентичны изолятам, выделенным из источника [19, 20]. Описаны случаи вспышек с продолжительным подъемом заболеваемости, при которых выявлялись несколько генетически различных штаммов в пределах одного населенного пункта или района и в группах риска [21–23]. Также выявление нескольких штаммов ВГА было описано во время массовых пищевых вспышек, источником которых были морепродукты [24].

За период с 2005 по 2010 г. нами было проанализировано 20 вспышек гепатита А, имевших место в 7 ФО. В 5 (25%) ведущим был установлен водный путь, в 4 (20%) – пищевой путь и в 9 (45%) – контактно-бытовой путь передачи возбудителя. 2 (10%) вспышки имели смешанный характер, при них отмечались как контактно-бытовой, так и водный пути передачи. 15 (75%) вспышек были вызваны субтипом IA ВГА, тогда как остальные 5 – субтипом IIIA. При филогенетическом анализе была выявлена значительная генетическая гетерогенность как среди изолятов субтипа IA, так и среди изолятов субтипа IIIA. Анализ штаммов ВГА, циркулировавших в пределах каждой из изученных вспышек, позволил в ряде случаев установить не только характер вспышки (завоз или распространение локального штамма), но также выдвинуть гипотезы о механизме ее развития и доказать единство фактора передачи возбудителя, подтвердить или опровергнуть связь как отдельных случаев заболевания, так и отдельных вспышек между собой [25]. Анализ молекулярно-генетических характеристик штаммов ВГА, циркулирующих во время вспышки, дает ценную дополнительную информацию для установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, а также временных и пространственных границ очага.

Определение генетических характеристик вируса гепатита В в эпидемиологических исследованиях

В 70-х годах прошлого века в ряде исследований, выполненных с использованием моноклональных антител, было выделено 9 различных субтипов (серотипов) HBsAg (ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq-, adrq+) [26]. Определение субтипа HBsAg пытались применить для изучения географической распространенности вариантов вируса гепатита В (ВГВ), однако дальнейшие исследования показали, что субтипы HBsAg не отражают истинного генетического разнообразия вируса [27]. К 1988 г. были секвенированы полные нуклеотидные последовательности 18 изолятов ВГВ различных субтипов, что послужило основой для разработки первой генетической классификации. H. Okamoto и соавт. [28] первоначально разделили имеющиеся изоляты ВГВ на 4 генетических группы, обозначенные A, B, C, D. Две новые группы, обозначенные Е и F, были выделены на основе анализа вариабельности в S-гене подтипов ayw4 и ayd4 [29]. Позднее были описаны еще 2 генотипа – G и H [30]. В последние несколько лет в литературе появились сообщения об обнаружении в азиатском регионе новых генетических вариантов ВГВ – I и J [31, 32].

Генотипы A, B, C, D и F сегодня принято разделять на ряд субгенотипов, которые обозначают арабскими цифрами. Для генотипа А известно 3 субгенотипа – А1, А2, А3. Для генотипа В точно установлено существование шести субгенотипов, для генотипов С и D – пяти субгенотипов и для генотипа F – четырех субгенотипов [33, 34]. Возможно, субгенотипическая классификация генотипов ВГВ будет дополняться, так как имеются сообщения о выделении ранее неизвестных генетических вариантов вируса.

Генотип А встречается во всех регионах земного шара, однако превалирует в Северной Америке, Западной Европе и Центральной Африке. Генотипы В и С встречаются в Юго-Восточной Азии. Генотип D является вторым по распространенности генотипом и доминирует в странах Средиземноморья, Индии, Восточной Европе и Северной Америке [35]. Генотип Е превалирует в Западной Африке; генотип F – в Южной и Центральной Америке, на Аляске; генотип G – в Центральной и Северной Америке, а также в Европе [36–39]. Генотип Н был обнаружен в Центральной Америке, Мексике и США [40]. Генотипы I и J были выявлены в Лаосе и Японии соответственно [31, 41]. Однако набирающие силу с каждым годом миграционные процессы приводят к постепенному стиранию четких границ географической распространенности тех или иных генотипов. В крупномасштабном исследовании, охватившем 17 гепатологических центров в США, были зарегистрированы 7 генотипов ВГВ: А (33%), В (21%), С (34%), D (9%), E (1%), F (1%) и G (1%). Кроме того, была выявлена достоверная зависимость между расовой принадлежностью и генотипом ВГВ. Так, генотип А был выявлен у белых и афроамериканцев, в то время как генотипы В и С превалировали среди азиатов. У американцев, родившихся в США, Европе, на Дальнем Востоке и в Юго-Восточной Азии, с наибольшей частотой выявлялись генотипы А, D, С, В соответственно [42].

Нами были изучены генетические характеристики 4328 изолятов ВГВ из 36 регионов РФ, входящих в состав всех восьми ФО, и из ряда стран СНГ. Результаты исследования показали, что в РФ большинство изолятов ВГВ (85%) относится к генотипу D, вторым по частоте (10,7%) является генотип А, 3,2% изолятов принадлежит генотипу С и в 1,1% случаев выявляются другие генотипы, сочетанные генотипы и рекомбинантные штаммы вируса [15, 43]. Во всех ФО доминирующим генотипом ВГВ был D, доля которого варьировала от 70 до 97,9%. В отдель­ных субъектах РФ [Республика Саха (Якутия), Кабардино-Балкарская Республика] значительную долю составлял генотип А (от 40 до 50%), а в Чукотском АО была существенно больше доля генотипа С (24,3%). Выявленные особенности могут быть следствием как географических характеристик территории, так и этнических различий, определяющих условия относительной изоляции популяции, проживающей на данной территории. В Армении, Украине и Кыргызстане доминирующим также был генотип D, который составлял более 80% случаев. Вторым по частоте встречаемости был генотип А (рис 3., см. на вклейке).

При анализе возрастных особенностей распределения генотипов ВГВ в РФ было выявлено, что наибольшая доля (17,7%) больных с генотипом А наблюдалась в возрастной группе 21–30 лет, несколько меньшая – в возрастных группах 15–20 и 31–40 лет (14,5 и 9,3% соответственно). Наименьшая доля больных с генотипом А ВГВ была в возрастных группах 0–14, 41–50 лет и 51 год и старше (4,4, 7,2 и 3,2% соответственно). Выявленные отличия распределения генотипов ВГВ в различных возрастных группах были статистически достоверны (критерий Краскела–Уоллиса; p < 0,001) [15].

При филогенетическом анализе было установлено, что каждый из генотипов А и С в России представлен только одним субгенотипом – А2 и С1 соответственно. Доминирующий на территории России генотип D характеризуется бо́льшим генетическим разнообразием и представлен тремя субгенотипами – D1, D2 и D3.

Российские штаммы ВГВ субгенотипа А2 не формируют отдельных кластеров и распределены в пределах филогенетической ветви, соответствующей этому субгенотипу, равномерно между штаммами, выявляющимися в Европе, Северной Америке, Африке и на Дальнем Востоке. Напротив, российские штаммы, принадлежащие субгенотипу C1, имеют тенденцию к формированию отдельного кластера. Штаммы субтипа D1, также как и штаммы субтипа A2, не формируют отдельных филогенетических ветвей в пределах своего кластера. Наблюдается равномерное их распределение по большей части между штаммами ВГВ из Турции, Ирана и Индии, хотя штаммы ВГВ из стран Европы также присутствуют в данном кластере. Субгенотип D2 на филогенетическом дереве представлен в абсолютном большинстве штаммами из России и стран Европы. Выделить значимые филогенетические ветви, отражающие географическую кластеризацию для штаммов данного субтипа, не подставляется возможным. На ветви филогенетического дерева, соответствующей субгенотипу D3, выделяется 2 кластера, один из которых является гетерогенным и включает штаммы ВГВ из стран Европы, Северной Америки, Африки, Азии и России, тогда как другой представлен только российскими штаммами вируса. Результаты анализа показали, что частота выявления субгенотипа D1 убывает с Запада на Восток с 45 до 12%, тогда как частота выявления субгенотипа D3, напротив, возрастает с 15 до 63% [15, 43].

Изучение серотипов ВГВ на основе анализа нуклеотидной последовательности изолятов позволило установить, что распространенность серотипа ad в РФ составляет 13,9%, а серотипа ay – 85%. В ряде исследований было показано, что антитела, специфичные к определенному генотипу вируса, могут в значительной степени определять формирование протективного иммунитета [44]. Также было установлено, что рекомбинантная вакцина против гепатита В, созданная на основе субтипа adw, обеспечивает хорошую, но не оптимальную защиту против гетерологичных штаммов вируса [45]. Принимая во внимание выявленные особенности формирования иммунного ответа, целесообразно учитывать информацию о циркулирующих серотипах ВГВ при выборе вакцинных препаратов для совершенствования программ иммунопрофилактики в РФ.

Одной из важных задач, которую призваны решать молекулярно-генетические методы, является анализ эпидемиологической связи случаев заболевания на основе изучения генетической вариабельности возбудителя. Ключевым вопросом для решения такой задачи является правильный выбор фрагмента генома возбудителя для дальнейшего анализа. Для гепатита В данный вопрос нельзя считать вполне решенным. Одни авторы использовали регион S-гена (поверхностный антиген), другие – Сore-регион (белок нуклеокапсида), многие предпочитают использовать сразу несколько регионов генома для секвенирования [46, 47]. Наиболее надежным и довольно обоснованным считается использование полной последовательности генома ВГВ, однако такой подход не может считаться универсальным, поскольку в развивающихся странах, которые эндемичны по ВГВ, секвенирование полной последовательности генома оказывается неоправданно дорогим.

Проведенное нами исследование по реконструкции филогенетических взаимоотношений генетических последовательностей ВГВ в 18 эпидемических очагах хронического гепатита В позволило выработать оптимальный алгоритм для расследования случаев групповой заболеваемости на основе молекулярно-генетических методов. Результаты показали, что на первом этапе анализа необходимо провести определение генотипа ВГВ у всех больных из исследуемого очага инфекции. Уже на этом этапе в некоторых ситуациях гипотеза о наличии эпидемиологической связи случаев может быть опровергнута. Если больные из очага инфицированы ВГВ одного и того же генотипа, следует переходить ко второму этапу, включающему секвенирование фрагментов генома вируса и их филогенетический анализ. Было показано, что филогенетический анализ необходимо проводить с применением как минимум двух вариабельных областей генома ВГВ, содержащих единственную рамку считывания (фрагментов С- и P-генов). Использование только одной области генома, как ранее предлагалось рядом авторов [48, 49], может быть недостаточным для выявления и доказательства достоверности филогенетической связи изолятов ВГВ. С помощью такого подхода удалось выявить несколько семейных очагов, в пределах которых эпидемиологическая связь случаев была сомнительна. В этих случаях недостаток или неоднозначность данных эпидемиологического анализа были компенсированы результатами филогенетического исследования.

При оценке результатов филогенетического анализа необходимо учитывать факторы, которые могут оказывать влияние на скорость эволюции вируса и, следовательно, снижать вероятность кластеризации. К таким факторам относятся особенности течения хронического гепатита В (сероконверсия по HBeAg) [50], особенности иммунного статуса пациента [51] и противовирусное лечение [52]. Важно отметить, что в исследованиях такого рода необходимо использовать контрольную группу пациентов, не имеющих явной эпидемиологической связи с пациентами из анализируемого очага, но проживающих в том же населенном пункте или районе. В этом случае уровень доказательности выявленной связи случаев из очага будет значительно выше.

В некоторых случаях для решения вопроса о связи случаев в очаге может быть недостаточно популяционного секвенирования, в связи с чем возникает необходимость предварительного клонирования исследуемых фрагментов генома изолятов ВГВ. В нашем исследовании при популяционном секвенировании фрагмента С-гена ВГВ, выделенного у одного из больных в семейном очаге, была выявлена высокая вырожденность последовательности. Такой результат свидетельствует о высокой гетерогенности вирусной популяции у больного и не позволяет выявить филогенетические связи с другими изолятами ВГВ. Клонирование и последующее секвенирование ряда клонов позволило решить эту проблему: выявить группу клонов, филогенетически связанную с изолятами ВГВ от других случаев из данного очага. Кроме того, детальная реконструкция филогенетических взаимоотношений изолятов ВГВ в пределах данного очага позволила предположить наиболее вероятную цепочку передачи инфекции [15].

Анализ мирового и отечественного опыта применения молекулярно-генетических методов в изучении биологического фактора эпидемического процесса гепатитов А и В показывает их высокую значимость для установления связи между случаями заболевания, идентификации источника возбудителя инфекции, мониторинга географического распространения его генетических вариантов, а также определения путей и факторов передачи. Широкое внедрение молекулярно-генетических методов исследования и филогенетического анализа в систему эпидемиологического надзора за вирусными гепатитами позволит повысить точность эпидемиологической диагностики, эпидемиологического прогноза и будет способствовать повышению качества и эффективности управления эпидемическим процессом.