Оптимизация мероприятий по профилактике септических осложений инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, на основе поиска биомаркеров клеток иммунной системы


Тутельян А.В., Писарев В.М., Акимкин В.Г., Брико Н.И., Брусина Е.Б., Зуева Л.П., Покровский В.И.

ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва; ФБУН НИИ дезинфектологии Роспотребнадзора, Москва; ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова; ГОУ ВПО Кемеровская государственная медицинская академия; ГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова
Представлены подходы к разработке информативных биомаркеров фенотипа клеточной поверхности клеток системы врожденного иммунитета и их секретируемых продуктов для выявления групп больных с высоким риском опасных для жизни осложнений бактериальных и вирусных инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи – ИСМП (сепсис, синдром системного воспалительного ответа). Группы потенциальных биомаркеров, отобранных для исследований, включают маркеры клеток иммунной системы (HLA-DR, CD88, СD14, СD33), не относящихся к лимфоидному ряду (моноцитарные и миелоидные клетки). Предполагается, что количественное определение профиля биомаркеров (так называемый иммунофеном) поможет выявить больных с наибольшим риском развития тяжелых, жизнеугрожающих осложнений ИСМП. Результаты исследования могут быть положены в основу обоснования персонифицированного подхода для проведения дорогостоящих профилактических или ранних терапевтических мероприятий, направленных на снижение смертности от осложнений ИСМП (ВБИ).

Наряду с огромной ролью, которую играют возбудители и механизмы их передачи в распространении и развитии инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), невозможно не учитывать значения биологических особенностей организма в реализации инфекционного процесса у конкретного больного. Знание молекулярных основ восприимчивости к ИСМП и механизмов, определяющих последствия возникшей ИСМП, может привести к развитию персонифицированного направления в профилактике осложненной ИСМП, характеризующейся высокой вероятностью летального исхода. Такое направление может быть основано как на ранней диагностике тяжелого течения ИСМП, так и на своевременном выявлении больных, предрасположенных к развитию смертельно опасных осложненных форм ИСМП (сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока), с целью оказания рациональной и специализированной помощи, включая применение высокотехнологичных методов профилактики и лечения.

К сожалению, оценка клинических и простых лабораторных признаков (повышение температуры, лейкоцитоз, тахикардия) не являются достаточно специфичными и чувствительными для диагностики септических состояний, особенно в случаях наличия у больных системного воспалительного синдрома без инфекции. Назначение антибиотиков, включая сильнодействующие препараты новых поколений с широким спектром действия, без четких показаний приводит к распространению резистентности и увеличению вероятности распространения ИСМП. Нерациональное использование антибиотиков, в частности в неонатальном периоде, приводит к дополнительному токсическому эффекту, риску развития атопических осложнений, нарушению экспрессии генов, контролирующих развитие желудочно-кишечного тракта, и транскрипции генов, ответственных за барьерные функции кишечника.

Ранняя диагностика осложненного течения ИСМП и своевременный прогноз состояния больных с помощью биомаркеров могли бы помочь оптимизировать медицинское применение инновационных, высокотехнологичных терапевтических ресурсов путем выявления больных, предрасположенных к развитию опасного для жизни осложнения – сепсиса и полиорганной недостаточности. Такой подход в комбинации с имеющимися способами профилактики и лечения ИСМП мог бы внести свой вклад в снижение смертности от сепсиса как все еще не такого редкого исхода ИСМП.

Мониторинг биомаркеров иммунной системы (иммунофенотипирование компонентов систем адоптивного и врожденного иммунитета, или иммунофеномика) представляется наиболее перспективным для персонализации терапии с целью более раннего и оптимизированного лечения.

Кандидаты таких биомаркеров существуют, целесообразность их применения для ранней диагностики сепсиса и прогноза течения септических состояний была продемонстрирована во многих исследованиях.

Так, прокальцитонин был апробирован для дифференциации сепсиса от системного воспалительного ответа (SIRS) неинфекционной природы. В клинически реальной концентрации прокальцитонин усиливал продукцию ИЛ-6, ИЛ-1 и ФНО мононуклеарами человека [1]. Другой иммунофеномный маркер – ИЛ-6 показал свою причастность к осложнениям сепсиса (дисфункция органов) как в клинических исследованиях, так и в экспериментальной модели сепсиса [2]. Перспективными предсказателями исхода явились также лактат [3], иммуномодулирующий белок HMGB1, накапливающийся в циркуляции в тканях в результате высвобождения из погибающих клеток [4, 5], а также некоторые комбинации биомаркеров, таких как лактат, прокальцитонин, аминоконцевой натрийуретический пептид В-типа [6].

Комбинирование биомаркеров (или группы биомаркеров) с микробиологическими и генетическими методами идентификации возбудителей ИСМП, безусловно, является наиболее оптимальным этапом диагностики с целью проведения терапевтических мероприятий, направленных на предотвращение смертности. Анализ литературы показывает наличие около 180 потенциальных биомаркеров сепсиса, имеющих диагностическую ценность, коррелирующих с его течением, исходом или патогенетическим значением [7–11]. Однако далеко не все маркеры-кандидаты верифицированы в клинике или имеют экспериментальное обоснование. В таблице представлены наиболее перспективные кандидаты, которые показали максимальную диагностическую ценность как маркеры, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью в клинических исследованиях и достаточно высокими показателями площади под кривой (AUC) при проведении ROC-анализа (Receiver Operating Characteristic), а также те маркеры, потенциальная ценность которых подтверждается как клиническими, так и экспериментальными (модельными) исследованиями.

Таблица.

* К – клинические исследования (свыше 20 больных в группе), Э – экспериментальные исследования с использованием моделирования сепсиса на мышах.

** Диагностическая (прогностическая) ценность маркера: специфичность и чувствительность диагноза (прогноза) >90%.

В первую очередь обращают на себя внимание отобранные маркеры-кандидаты, способствующие раннему диагнозу септической инфекции с высокой (> 90%) специфичностью и чувствительностью, что важно для своевременного начала антибиотикотерапии. К таким биомаркерам относятся индуцируемый интерфероном протеин 10 (IP-10), или хемокин CXCL10, обеспечивающий привлечение антибактериальных нейтрофилов и Т-клеток в места инфекции. При сравнении диагностической ценности многих цитокинов и хемокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12р70, ИЛ-8, ФНО, MIG, MCP-1, GRO, RANTES) у недоношенных младенцев количественное определение именно IP-10 оказалось наиболее информативным для постановки диагноза септической инфекции при некротизирующем энтероколите. Определение концентрации хемокина с помощью иммуноферментного анализа в условиях минимального объема (50 мкл) плазмы позволило установить все случаи септицемии позднего начала (начавшейся по истечении 3 сут после рождения) при некротизирующем энтероколите со специфичностью 89% и чувствительностью 93% у детей с концентрацией IP-10 свыше 1250 нг/мл, выявляемой в день подозрения септической инфекции или через 24 ч после этого [33].

Однако для выявления случаев пневмонии ценность метода была значительно ниже. Комбинация хемокина с другими биомаркерами, использованными в данной работе, лишь слегка повышала специфичность и отрицательную предсказательную ценность метода у младенцев. Ценность этого маркера для раннего выявления сепсиса у взрослых не установлена. Другой маркер – фосфолипаза 2 группы II (PLA2-II) оказался диагностически значимым при сепсисе у взрослых больных. Так, повышенная концентрация PLA2-II выявлялась уже в раннюю фазу бактериемии (с пиком через 12–24 ч после поступления в отделение интенсивной терапии), значения AUC для этого маркера превышали таковые для С-реактивного белка, который рутинно используется для мониторинга воспаления [34]. Высокие (свыше 90%) специфичность и чувствительность выявления бактериемии наблюдали в течение первых 24 ч нахождения в стационаре. Аналогичной диагностической ценностью обладало и определение прокальцитонина, используемое в настоящее время в отечественных клиниках [38–40].

Использование проточной цитофлюориметрии цельной крови с применением соответствующих антител позволяет в небольшом количестве крови (25–50 мкл на определение) количественно выявлять экспрессию клеточно-ассоциированных маркеров CD64, CD11b, HLA-DR на поверхности гранулоцитов или мононуклеарных клеток для диагностики сепсиса или прогноза его течения с высокой специфичностью и чувствительностью. Так, высокие значения первых двух характерны для детей и взрослых при сепсисе соответственно, тогда как снижение экспрессии HLA-DR на поверхности моноцитов позволяло прогнозировать вероятность инфекции после сердечно-сосудистой хирургических вмешательств (и септических осложнений у больных в отделении интенсивной терапии; см. таблицу).

Прогностической ценностью при септической инфекции обладало и снижение экспрессии рецепторов компонента комплемента С5а (CD88 и C5L2), а также молекул TLR2/CD14 на клетках крови больных, а уровень экспрессии маркеров апоптоза PD1 и PD1L на поверхности моноцитов прямо коррелировал с вероятностью летального исхода (см. таблицу). Экспериментальные исследования показали, что снижение экспрессии маркеров является следствием их интернализации в связи с наличием в крови или большого количества соответствующих лигандов – бактериальных продуктов (в случае TOLL-подобных рецепторов), или молекул С5а, активированных в результате системной воспалительной реакции. Использование таких маркеров особенно перспективно, поскольку они имеют непосредственное отношение к патогенезу септического состояния. Однако их реальная прогностическая ценность для ИСМП нуждается в подтверждении с исследованием разных категорий больных.

Некоторые маркеры могут быть в дальнейшем использованы не только для отбора больных с целью персонализации терапии, но и для оценки реакции на предпринятое лечение. Такие задачи можно решить только с помощью биомаркеров, обладающих достаточно высокой чувствительностью и специфичностью в оценке эффективности лечения. Подобные исследования только начинаются, и ожидается, что они приведут к значительному предотвращению летальных исходов септических ИСМП, а также к более эффективному и рациональному использованию дорогостоящих способов терапии сепсиса, включая введение рекомбинантных антагонистов провоспалительных цитокинов [41]. Одним из примеров является определение уровня активного протеина С в крови для оптимизации лечения рекомбинантным активным продуктом, разрешенным Администрацией по продуктам питания и лекарствам США к клиническому применению для лечения сепсиса (клинические испытания NCT00386425, www.clinicatrials.gov).

В настоящее время в США также проходят клинические испытания для установления диагностической ценности определения концентрации прокальцитонина в сыворотке для оптимизации лекарственной терапии сепсиса (клинические испытания NCT00832039 www.clinicatrials.gov). В предварительных клинических исследованиях получены обнадеживающие данные при использовании прокальцитонина как маркера при выработке решения о прекращении антибиотикотерапии [42, 43].

Хотя тесты с использованием некоторых биомаркеров (см. таблицу) имеют неплохие значения специфичности и чувствительности для раннего диагноза или прогноза развития лекарственной терапии сепсиса, широкое клиническое применение биомаркеров возможно при достижении еще больших (приближающихся к 100%) значений специфичности и чувствительности, т.е. при практически полном отсутствии ложноположительных и ложноотрицательных прогнозов течения и диагноза сепсиса. Считается, что биомаркеры могут быть наиболее ценны в комбинации. Недавнее клиническое исследование выявило, что специфичность диагноза сепсиса может быть повышена до 96% при использовании двух количественных маркеров – прокальцитонина и бифазной характеристики кривой при определения тромбопластина [44]. При этом достаточно высокой оказалась негативная предсказательная ценность теста (96%), позволяющая почти наверняка выявить случаи без сепсиса. Последнее было успешным и при определении продуктов деградации фибрина с помощью иммуноферментного анализа – отрицательный тест позволил в 100% случаев отвергнуть диагноз сепсиса, вызванного грамотрицательными бактериями [45].

Еще одним примером успешного применения сочетания биомаркеров с целью оптимизации стратегии лечения является исследование, проведенное в Китайском университете Гонконга [46]. Авторы обнаружили, что у недоношенных детей с повышенным риском септицемии позднего начала и некротизирующего энтероколита имелось специфическое соотношение проаполипопротеина CII и варианта сывороточного амилоида (SAA), содержащего дес-аргинин. Диагностическая ценность индекса, рассчитанного по предложенной авторами формуле, была высока: у больных с индексом выше 0,75 чувствительность и специфичность диагноза составляли 90 и 95% соответственно.

В этой связи следует отметить, что для верификации диагностической и прогностической ценности комбинации перспективных биомаркеров, в отношении которых уже имеются и клинические результаты, и экспериментальное обоснование (см. таблицу), необходимо проведение полноценных клинических исследований в отечественных условиях. Такие исследования могли бы включать в первую очередь маркеры-кандидаты, имеющие патогенетическое значение в развитии и течении септической инфекции (цитокины, хемокины) или непосредственно отражающие активность патогенетически значимых факторов, совокупность которых может определять неблагоприятный исход болезни (уровень экспрессии клеточных рецепторов).


Литература


1. Liappis A.P., Gibbs K.W., Nylen E.S. Exogenous procalcitonin evokes a pro-inflammatory cytokine response. Inflamm. Res. 2011; 60(2): 203–207.
2. Claus R.A., Otto G.P., Deigner H.P., Bauer M. Approaching clinical reality: markers for monitoring systemic inflammation and sepsis. Curr. Mol. Med. 2010; 10 (2): 227–235.
3. Nguyen H.B., Loomba M., Yang J.J. et al. Early lactate clearance is associated with biomarkers of inflammation, coagulation, apoptosis, organ dysfunction and mortality in
severe sepsis and septic shock. J. Inflamm. 2010; 7: 6–16.
4. Gibot S., Massin F., Cravoisy A. et al. Highmobility group box 1 protein plasma concentrations during septicshock. Intensive Care Med. 2007; 33: 1347–1353.
5. Suda K., Takeuchi H., Ishizaka A., Kitagawa Y. Highmobility-group box chromosomal protein 1 as a new target for modulating stress response. Surg. Today. 2010; 40 (7): 592–601.
6. Phua J., Koay E.S., Lee K.H. Lactate, procalcitonin, and amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide versus cytokine measurements and clinical severity scores for prognostication in septic shock. Shock 2008; 29: 328–333.
7. Gori C.S, Magrini L., Travaglino F., Di Somma S. Role of biomarkers in patients with dyspnea. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2011; 15 (2): 229–240.
8. Standage S.W., Wong H.R. Biomarkers for pediatric sepsis and septic shock. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2011; 9 (1): 71–79.
9. Reinhart K., Hartog C.S. Biomarkers as a guide for antimicrobial therapy. Int. J. Antimicrob. Agents 2010; 36 (Suppl 2): S17–S21.
10. Pierrakos C., Vincent J.L. Sepsis biomarkers: a review. Crit Care 2010; 14 (1): R15.
11. Mancini N ., Carletti S., Ghidoli N. The era of molecular and other non-culture-based methods in diagnosis of sepsis. Clin. Microbiol. Rev. 2010; 23 (1): 235–251.
12. Nupponen I., Andersson S., Jarvenpaa A.L. et al. Neutrophil CD11b expression and circulating interleukin-8 as diagnostic markers for early-onset neonatal sepsis. Pediatrics 2001; 108: E12.
13. Nuutila J., Hohenthal U., Laitinen I. et al. Simultaneous quantitative analysis of FcgammaRI (CD64) expression on neutrophils and monocytes: a new, improved way to detect infections. J. Immunol. Methods 2007; 328: 189–200.
14. Nuutila J. The novel applications of the quantitative analysis of neutrophil cell surface FcgammaRI (CD64) to the diagnosis of infectious and inflammatory diseases. Curr. Opin. Infect. Dis. 2010; 23( 3): 268–274.
15. Cid J., Garcia-Pardo G., Aguinaco R et al. Neutrophil CD64: diagnostic accuracy and prognostic value in patients presenting to the emergency department. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011; 20: 178–182.
16. Cheron A., Monneret G., Landelle C. et al. Low monocytic HLA-DR expression and risk of secondary infection. Ann. Fr. Anesth. Reanim. 2010; 29 (5): 368–376.
17. Cheron A., Floccard B., Allaouchiche B. et al. Lack of recovery in monocyte human leukocyte antigen-DR expression is independently associated with the development of sepsis
after major trauma. Crit. Care 2010; 14 (6): R208.
18. Strohmeyer J.C., Blume C., Meisel C. et al. Standardized immune monitoring for the prediction of infections after cardiopulmonary bypass surgery in risk patients. Cytometry B Clin. Cytom. 2003; 53 (1): 54–62.
19. Huber-Lang M., Sarma J.V., Rittirsch D. et al. Changes in the novel orphan, C5a receptor (C5L2), during experimental sepsis and sepsis in humans. J. Immunol. 2005; 174: 1104–1110.
20. Ward P.A. The harmful role of c5a on innate immunity in sepsis. J. Innate Immun. 2010; 2 (5): 439–445.
21. Schaaf B., Luitjens K., Goldmann T. et al. Mortality in human sepsis is associated with downregulation of Toll-like receptor 2 and CD14 expression on blood monocytes. Diagn. Pathol.
2009; 16 (4): 12.
22. Guignant C., Lepape A., Huang X. et al. Programmed death- 1 levels correlate with increased mortality, nosocomial infection and immune dysfunctions in septic shock patients. Crit. Care. 2011; 15 (2): R99.
23. Maghraby S.M., Moneer M.M., Ismail M.M. et al. The diagnostic value of C-reactive protein, interleukin-8, and monocyte chemo tactic protein in risk stratification of febrile neutropenic children with hematologic malignancies. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 2007; 29: 131–136.
24. Fujishima S., Sasaki J., Shinozawa Y. et al. Serum MIP-1 alpha and IL-8 in septic patients. Intensive Care Med. 1996; 22: 1169–1175.
25. Heper Y., Akalin E.H., Mistik R. et al. Evaluation of serum C-reactive protein, procalcitonin, tumor necrosis factor alpha, and interleukin-10 levels as diagnostic and prognostic parameters in patients with community-acquired sepsis, severe sepsis, and septic shock. Eur. J. Clin. Microbiol.
Infect. Dis. 2006; 25: 481–491.
26. Wang C.H., Gee M.J., Yang C., Su Y.C. A new model for outcome prediction in intra- abdominal sepsis by the linear discriminant function analysis of IL-6 and IL-10 at different heart rates. J. Surg. Res. 2006; 132: 46–51.
27. Marchant A., Alegre M.L., Hakim A. et al. Clinical and biological significance of interleukin-10 plasma levels in patients with septic shock. J. Clin. Immunol. 1995; 15: 266–273.
28. Pinsky M.R., Vincent J.L., Deviere J. et al. Serum cytokine levels in human septic shock. Relation to multiple-system organ failure and mortality. Chest 1993; 103: 565–575.
29. Sherwin C., Broadbent R., Young S. Utility of interleukin-12 and interleukin-10 in comparison with other cytokines and acute-phase reactants in the diagnosis of neonatal sepsis.
Am. J. Perinatol. 2008; 25: 629–636.
30. Ng P.C., Li K., Leung T.F. et al. Early prediction of sepsisinduced disseminated intravascular coagulation with interleukin-10, interleukin-6, and RANTES in preterm infants. Clin. Chem. 2006 ; 52 (6): 1181–1189.
31. Ng P.C., Li K., Chui K.M. et al. IP-10 is an early diagnostic marker for identification of late-onset bacterial infection in preterm infants. Pediatr. Res. 2007; 61: 93–98.
32. Fotopoulos S., Mouchtouri .A., Xanthou G. et al. Inflammatory chemokine expression in the peripheral blood of neonates with perinatal asphyxia and perinatal or nosocomial infections. Acta Paediatr. 2005; 94 (6): 800–806.
33. Gibot S., Cravoisy A., Dupays R. Combined measurement of procalcitonin and soluble TREM-1 in the diagnosis of nosocomial sepsis. Scand. J. Infect. Dis. 2007; 39 (6–7):
604–608.
34. Rintala E.M., Aittoniemi J., Laine S. et al. Early identification of bacteremia by biochemical markers of systemic inflammation. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 20014 61: 523–530.
35. Saukkonen K., Lakkisto P., Pettila V. et al. Cell-free plasma DNA as a predictor of outcome in severe sepsis and septic shock. Clin Chem. 2008; 54 (6): 1000–1007.
36. Saukkonen K., Lakkisto P., Varpula M. et al. Association of cell-free plasma DNA with hospital mortality and organ dysfunction in intensive care unit patients. Intensive Care Med. 2007; 33 (9): 1624–1627.
37. Rhodes A., Wort S.J., Thomas H. et al. Plasma DNA concentration as a predictor of mortality and sepsis in critically ill patients. Crit. Care. 2006; 10 (2): R60.
38. Сепсис: классификация, клинико-диагностическая концепция и лечение: Практич. руководство /Под ред. В.С. Савельева, Б.Р. Гельфанда. М.: Медицинское
информационное агентство, 2010.
39. Аджамов Б.М. Роль прокальцитонина в определении вида возбудителя инфекционного процесса. Инфекции в хирургии 2010; 8 (3) 5–8.
40. Тест на прокальцитонин: алгоритмы применения и новые возможности /Под ред. Н.В.Белобородова, Д.А. Попова. М., 2008.
41. Rosenthal V.D., Maki D.G., Rodrigues C. et al. International nosocomial infection control consortium investigators. Impact of international nosocomial infection control consortium (INICC) strategy on central line-associated bloodstream infection rates in the intensive care units of 15 developing countries. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 2010; 31 (12): 1264–1272.
42. Nobre V., Harbarth S., Graf J.D. et al. Use of procalcitonin to shorten antibiotic treatment duration in septic patients: a randomized trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008; 177: 498–505.
43. Briel M., Schuetz P., Mueller B. et al. Procalcitonin-guided antibiotic use vs a standard approach for acute respiratory tract infections in primary care. Arch. Int. Med. 2008; 168: 2000–2007.
44. Zakariah A.N., Cozzi S.M., Van Nuffelen M. Combination of biphasic transmittance waveform with blood procalcitonin levels for diagnosis of sepsis in acutely ill patients. Crit. Care
Med. 2008; 36 (5): 1507–1512.
45. Deitcher S.R., Eisenberg P.R. Elevated concentrations of crosslinked fibrin degradation products in plasma. An early marker of gram-negative bacteremia. Chest 1993; 103 (4): 1107–1112.
46. Lehmann L.E., Book M., Hartmann W. et al. A MIF haplotype is associated with the outcome of patients with severe sepsis: a case control study. J. Trans. Med. 2009; 26 (7): 100.


Об авторах / Для корреспонденции


Тутельян Алексей Викторович, д-р мед. наук, зав. лаб. внутрибольничных инфекций и эпидемиологического надзора ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора
Адрес: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а
Телефон: (8-495) 305-57-55
Е-mail: bio-tav@yandex.ru

Писарев Владимир Митрофанович, д-р мед. наук, проф., вед. науч. сотр. лаб. внутрибольничных инфекций и эпидемиологического надзора ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; адъюнкт-проф. Медицинского центра университета Небраски, Омаха, США

Акимкин Василий Геннадьевич, член-корр. РАМН, д-р мед. наук, проф., зам. директора по научной работе ФБУН НИИ дезинфектологии Роспотребнадзора

Брико Николай Иванович, акад. РАМН, д-р мед. наук, проф., зав. каф. эпидемиологии и доказательной медицины ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова

Брусина Елена Борисовна, д-р мед. наук, проф., зав. каф. эпидемиологии ГОУ ВПО Кемеровская государственная медицинская академия

Зуева Людмила Павловна, акад. РАЕН, д-р мед. наук, проф., зав. каф. эпидемиологии с курсами эпидемиологии, паразитологии и хирургических инфекций ГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова

Покровский Валентин Иванович, акад. РАМН, д-р мед. наук, проф., дир. ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора


Похожие статьи


Бионика Медиа