Инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), являются серьезной проблемой современного здравоохранения. По современным данным, ежегодно в России от ИСМП страдает около 8% пациентов в стационарах, что наносит значительный ущерб здоровью населения [1].

Борьба с ИСМП является очень важной и сложной проблемой. В настоящее время основным средством лечения и профилактики бактериальных инфекций в стационарах являются антибиотики. В условиях массового и нерационального применения антибиотиков у возбудителей ИСМП формируется множественная резистентность к существующим антибактериальным препаратам, вследствие чего их эффективность снижается или зачастую отсутствует.

Госпитальные штаммы, приобретая высокую вирулентность и множественную резистентность к химиопрепаратам, антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам, получают способность к паразитическому существованию у пациентов госпиталей. Широкий спектр антимикробных препаратов в современной медицине, применяемых с лечебной и профилактической целями, лишь частично уничтожает микробов и приводит к селекции наиболее устойчивых штаммов.

В сообщении ВОЗ от 6 апреля 2011 г. говорится, что «существующие противомикробные препараты теряют свою эффективность. В то же время в разработке новых противомикробных препаратов наблюдается упадок. При сохранении этой тенденции арсенал средств для борьбы с устойчивыми микроорганизмами скоро будет исчерпан. Угроза со стороны лекарственной устойчивости возрастает. Необходимы срочные действия» [2].

Кроме того, стоимость многих современных, но не всегда эффективных антибиотиков чрезвычайно высока. Также остро стоит вопрос о неблагоприятном побочном действии антибиотикотерапии на макроорганизм человека (отрицательное воздействие на нормальный биоценоз).

Таким образом, важным аспектом современного здравоохранения является поиск дополнительных средств борьбы с бактериальными инфекциями. Такими высокоэффективными средствами являются бактериофаги.

Бактериофаги лишены многих недостатков антибиотиков, обладают строгой избирательностью в отношении возбудителя инфекции, не влияют на нормальный биоценоз человека, а также дешевле многих современных антибактериальных препаратов.

С другой стороны, бактериофаги играют очень важную роль в эволюции бактерий и в реализации их патогенного потенциала. В многочисленных генетических исследованиях убедительно продемонстрировано значение бактериофагов в эволюции целого ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [3–5].

Однако остается не изученной проблема рационального применения бактериофагов, поскольку не существует достаточно обоснованных теоретических и практических подходов к использованию их в условиях стационаров. Этим, в частности, объясняется недостаточная эффективность коммерческих фагов. Отсутствуют работы по изучению экологических аспектов стихийной циркуляции в стационарах бактериофагов совместно с возбудителями ИСМП.

Материалы и методы

Исследования проводили в нескольких лечебных учреждениях: травматологическом (клинике гнойной остеологии), двух ожоговых, двух урологических и гинекологическом стационарах.

Бактериофаги выделяли из клинического материала и объектов внешней среды стационара. Выделение фагов осуществляли первоначальным суточным культивированием исследуемого образца с трехчасовыми фагочувствительными штаммами в жидкой среде с последующей проверкой литической активности фильтрата материала на твердых питательных средах.

Первичное выделение культур микроорганизмов проводили общепринятыми микробиологическими методами.

Все выделенные штаммы подвергались генетическому типированию методом ПЦР по наличию/отсутствию генов следующих факторов патогенности (суперантигенов): энтеротоксины A, B, C, M (sea, seb, sec, sem), лейкоцидин Пантона—Валлентайна (pvl), белок токсического шока (tst). ПЦР проводили по методике M. Mehrotra и M. Lina. Результаты ПЦР оценивались после электрофореза в 1% агарозном геле в ультрафиолетовом освещении.

Для получения высокоактивного лечебного бактериофага против синегнойной палочки проводилась адаптация фагов путем селектирующих пассажей на чувствительных культурах.

Синегнойный бактериофаг как лечебное и противоэпидемическое средство применяли среди пациентов травматологического стационара однократно в день, местно, путем орошения открытого патологического очага или введения в свищевые ходы в объеме в зависимости от обширности очага поражения (10–20 мл). Курс применения фага для одного пациента составлял 5 дней. В работе использовали коммерческие пиобактериофаги производства «Биофаг» (Уфа), а также препарат серии С22, приготовленный Уфимским предприятием из выделенных нами фагов.

Кроме оценки лечебного действия определяли эпидемиологический эффект применения бактериофага. Эпидемиологическая оценка проводилась по изменению интенсивности эпидемического процесса синегнойных инфекций после начала использования бактериофагов, выражавшемуся в снижении частоты внутрибольничных заражений. Для доказательства внутрибольничных заражений использовали метод эпидемиологического обследования, при этом данные об эпидемиологических связях подтверждались определением внутривидовых характеристик штаммов путем генотипирования, антибиотикотипирования, а также фаготипирования с помощью разработанного тест-набора фагов.

Данные подвергались статистической обработке с использованием программ Epi Info, WHONET, SPSS, PEPI.

Результаты и обсуждение

Как показали наши наблюдения, в стационарах наряду с циркуляцией госпитальных штаммов возбудителей инфекций происходит достаточно интенсивная стихийная циркуляция их бактериофагов.

Интенсивность циркуляции фагов варьирует в зависимости от вида возбудителя и типа стационара и достигает, например, для синегнойной палочки в травматологическом стационаре 29 на 100 пациентов. Интенсивность циркуляции фагов в различных урологических отделениях, изученных в ходе наших исследований, может варьировать от 1,4 до 7,7 на 100 пациентов.

Интенсивность циркуляции фагов, скорее всего, отражает частоту перекрёстного инфицирования пациентов микробами и фагами в отделениях. Бактериофаги, по-видимому, распространяются в стационаре так же, как и возбудители внутрибольничных инфекций, посредством рук медицинского персонала, инструментария и объектов внешней среды, выступающих в качестве факторов передачи.

Зависимости между динамикой выявления фагов и инцидентностями ИСМП установить не удалось.

В ходе исследований было выявлено, что в стационарах фаги в значительном числе случаев обнаруживались с бактериями-хозяевами в одном и том же биотопе (например, в одной и той же ране).

Отсутствие лизиса микроба одновременно выделенным из того же клинического материала бактериофагом наводит на мысль об их равновесном саморегулирующемся взаимодействии в естественных условиях, обеспечивающем сохранение популяций как возбудителя инфекции (бактерии-хозяина), так и его бактериофага.

Результатом такой коэволюции бактерий-возбудителей и их фагов является формирование в стационаре своеобразных паразитарных систем, представленных популяцией бактериофагов, популяцией возбудителя и окружающей их госпитальной средой. При этом необходимо отметить, что стихийно циркулирующие фаги, входящие в такие экосистемы, не обладая достаточной вирулентностью для уничтожения возбудителей инфекций, не способны оказывать ни клинического, ни эпидемиологического эффекта, а наоборот, способствуют формированию негативных свойств у бактерий путём лизогении. Участие мобильных генетических элементов (МГЭ) также важно для формирования данных паразитарных систем. МГЭ часто способствуют приобретению бактериями патогенных свойств и нередко переносятся фагами. Необходимо учитывать не только одномоментный, но и стохастический эффекты воздействия фагов и МГЭ на бактерии в условиях стационара, увеличивающие адаптационные возможности микроорганизмов.

Формирование в стационарах таких систем (возбудителей и их фагов) может, как было указано, влиять на эволюцию госпитальных штаммов с выработкой у последних негативных свойств. В частности, результаты наших исследований показали формирование дополнительной антибиотикорезистентности у штаммов синегнойной палочки и энтерококка. У псевдомонады это явление прослеживалось в отношении ципрофлоксацина, а также гентамицина, устойчивость к которому возрастала в 8 раз; у энтерококка – в отношении меропенема и офлоксацина.

При изучении закономерностей циркуляции в стационарах бактерий и их бактериофагов важно понимание механизмов сосуществования этих микроорганизмов.

По нашим представлениям, одна из причин сосуществования – это преобладание среди фагов, циркулирующих в стационаре, умеренных над вирулентными по отношению к микробам — возбудителям инфекций. Вероятно, поэтому имеет место фагоустойчивость бактерий-возбудителей, связанная, скорее всего, с лизогенией (79% выделенных культур госпитальных штаммов в урологическом стационаре были фагорезистентными, вероятно, лизогенными; в 62,5% случаев P. aeruginosa, выделенная у пациентов травматологического стационара, не лизировалась фагом, выделенным одновременно из той же раны).

Мы обнаруживали профаговые последовательности в ДНК всех исследованных методом ПЦР штаммов синегнойной палочки, причем некоторые штаммы были лизогенны по двум фагам. Ген ctx (фаговый цитотоксин) обнаруживался в 100% случаев, а последовательность профага Bacto1 обнаружена в 47,1%.

С использованием современных молекулярно-генетических методов нами было проведено исследование штаммов золотистого стафилококка на наличие генов, кодирующих факторы патогенности (суперантигены): энтеротоксины A, B, C, M (sea, seb, sec, sem), лейкоцидин Пантона—Валлентайна (pvl), белок токсического шока (tst) (см. таблицу).

Таблица.

Известно, что все эти факторы вирулентности кодируются бактериофагами. Это обстоятельство является еще одним аргументом необходимости обратить пристальное внимание на изучение циркуляции в стационарах бактериофагов, способных повлиять на формирование свойств возбудителей ИСМП.

Несмотря на обширные сведения о влиянии бактериофагов на свойства бактерий, процессы эволюции именно госпитальных штаммов под влиянием фагов на данный момент изучены недостаточно.

Другой крайне важный аспект изучения бактериофагов связан с вопросом ограниченных возможностей антибиотикотерапии и поиска альтернативных высокоэффективных средств борьбы с ИСМП. Таким средством могут служить бактериофаги, которые, с одной стороны, влияют на формирование госпитальных штаммов, с другой — могут быть эффективным средством лечения и профилактики ИСМП. Последнее возможно только при условии применения высоковирулентных препаратов фагов. Если допустить использование в стационаре препаратов фагов, не обладающих достаточной литической активностью, это может активизировать указанные выше механизмы формирования госпитальных штаммов с их участием.

Наиболее показательными являются результаты эффективного применения синегнойных бактериофагов в отделении гнойной остеологии, где традиционные методы антибактериального лечения зачастую не давали положительных результатов. Терапия гнойно-септических инфекций (ГСИ) в отделении проводилась с помощью бактериофагов, адаптированных к госпитальным штаммам бактерий, циркулирующих в данном стационаре. До начала применения бактериофагов в отделении отмечался очень высокий уровень заболеваемости синегнойной инфекцией – 40,8% пациентов страдали ГСИ, вызванными синегнойной палочкой. После начала фаготерапии уровень заболеваемости резко снизился — до 8,9%.

Результаты статистического анализа [p< 0,001, относительный риск (RR) = 0,22 (0,13–0,39), NNT (число больных, нуждающихся в лечении, для предотвращения одного случая синегнойной инфекции) = 3 (2,4–4,6)] убедительно свидетельствуют об эффективности фаготерапии и фагопрофилактики.

У больных уже после 3-кратного применения бактериофага резко изменялось течение раневого процесса: уменьшалось количество отделяемого из раны, усиливалась грануляция, эпителизация и происходило заживление раны. Фаготерапия во всех случаях оказалась эффективной как у пациентов в послеоперационном периоде, способствуя элиминации возбудителя послеоперационного осложнения и дальнейшему заживлению раны, так и у больных в предоперационном периоде в плане подготовки к последующему успешному оперативному лечению.

Не менее показателен опыт использования бактериофагов в отделении реанимации новорожденных для купирования вспышек синегнойной и клебсиеллезной инфекций. Традиционная антибактериальная терапия не приносила должного результата, и проблему борьбы с госпитальными штаммами решали путем применения соответствующих адаптированных бактериофагов. После однократного применения фагов путем обработки кожных и слизистых покровов новорожденных и распыления фагов во внешней среде резко снизились показатели заболеваемости, уменьшилась интенсивность циркуляции госпитальных штаммов возбудителей. В процессе дальнейшего применения бактериофагов удалось полностью элиминировать госпитальные штаммы синегнойной палочки и клебсиеллы из стационара.

Таким образом, несмотря на обширные сведения о влиянии бактериофагов на свойства бактерий, процессы эволюции госпитальных штаммов под влиянием фагов на данный момент изучены недостаточно.

С позиций эпидемиологии важно изучение способности фагов участвовать в приобретении микробами свойств патогенности по отношению к человеку, устойчивости к применяемым лечебно-профилактическим средствам и склонности к эпидемическому распространению в популяции людей.

Очевидно, что разработка новых мероприятий инфекционного контроля над возбудителями ИСМП должна базироваться на подробном изучении взаимодействий между популяциями микробов – возбудителей ИСМП и стихийно циркулирующих фагов.

Разработка мер эффективной борьбы с госпитальными штаммами должна проводиться на основе полученных знаний о механизмах их формирования под влиянием бактериофагов и МГЭ.

Теоретические знания в этих областях будут способствовать более эффективному использованию фагов для лечения и профилактики ИСМП. Использование высокоактивных фагов, способных к ликвидации устойчивых саморегулирующихся взаимоотношений в паразитарных экосистемах и широкому распространению в госпитальных условиях, позволяет добиться как выраженного клинического, так и эпидемиологического эффекта.

Исходя из этого, важной научной и практической проблемой является изучение роли бактериофагов в формировании госпитальных (эпидемических) штаммов—возбудителей ИСМП, механизмов их формирования и особенностей саморегуляции эпидемического процесса ИСМП. Знание этих явлений необходимо для решения проблем фаготерапии и профилактики ИСМП, а также разработки новых мероприятий по эпидемиологическому надзору и прогнозирования развития эпидемического процесса ИСМП.