Наиболее частыми и тяжелыми осложнениями у пациентов с ВИЧ-инфекцией являются поражения центральной нервной системы (ЦНС). Они могут быть непосредственно связаны с воздействием ВИЧ на клетки головного мозга или являться следствием развития аутоиммунных процессов, оппортунистических и вторичных заболеваний, злокачественных новообразований и других факторов. С момента появления антиретровирусной терапии число случаев поражений ЦНС оппортунистическими инфекциями уменьшилось, однако спектр данных нарушений не изменился [1, 2].

Установлено, что главной причиной неврологической патологии у больных на поздних стадиях ВИЧ-инфекции является церебральный токсоплазмоз: 34,7% случаев поражения головного мозга и 11% – в виде генерализованного процесса с вовлечением головного мозга, печени, легких и глаз. Ежегодная частота выявления криптококкового менингита среди поражений ЦНС при ВИЧ-инфекции составляет от 0,5 до 1,4%. Цитомегаловирусный вентрикулоэнцефалит ежегодно диагностируют в 0,9–4% случаев поражения ЦНС. Туберкулезный менингоэнцефалит регистрирют у 16–32% больных. В 20% случаев причина поражения ЦНС остается нерасшифрованной [3].

Этиологическая диагностика поражений ЦНС у пациентов с ВИЧ-инфекцией представляет собой особую сложность, обусловленную нечеткостью клинической картины, а также недостаточной информативностью рутинных методов исследования [1–3].

У больных ВИЧ-инфекцией с выраженным иммунодефицитом использование иммунологических методов, основанных на определении маркеров оппортунистических инфекций (специфических антител классов IgА, IgG с определением авидности, IgМ), ограничено [1–4]. Поэтому основную роль при верификации диагноза у данных пациентов играет использование прямых методов исследования.

Традиционно используемые рутинные бактериологические и паразитологические методы обладают высокой специфичностью, но низкой чувствительностью. Применение вирусологических методов ограничено в связи с их технической сложностью и высокой стоимостью. Основным недостатком культуральных методов лабораторной диагностики также является продолжительность исследования. Так, для выделения и идентификации C. neoformans необходимо не менее 3–10 дней [5]. Таким образом, использование более чувствительных и точных методик на основе ПЦР является наиболее перспективным.

Цель исследования – оценить эффективность использования молекулярно–биологических методов (ПЦР) при этиологической диагностике оппортунистических инфекций ЦНС у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Материалы и методы

В период с января 2009 г. по июнь 2010 г. обследовано 96 пациентов с ВИЧ–инфекцией на различных стадиях заболевания (диагноз подтвержден стандартными методами) с клиническими признаками поражения ЦНС (общемозговая, менингеальная, очаговая симптоматика), проходивших стационарное лечение в ИКБ № 2 Москвы. Возраст пациентов составил от 19 до 52 лет (средний возраст 26 лет). Среди них женщины составляли 31%, мужчины – 69%. Обследование включало динамическое клиническое наблюдение, оценку неврологического статуса, в том числе с использованием метода нейровизуализации [магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга], определение иммунного статуса, общий клинический, бактериологический и микроскопический анализ спинномозговой жидкости (СМЖ), исследование периферической крови, СМЖ с использованием молекулярно-биологического (ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме реального времени) и иммунологического (ИФА) методов диагностики. При летальном исходе (10 пациентов) диагноз был верифицирован на основании результатов патологоанатомического исследования.

Материалом для исследования являлись 96 образцов периферической крови и 96 образцов СМЖ. Методом ПЦР в крови выявляли ДНК Varicella–Zoster virus, количественно определяли ДНК Cytomegalovirus hominis (ЦМВ), РНК ВИЧ 1-го типа, в СМЖ – ДНК Toxoplasma gondii, Varicella–Zoster virus и количественно определяли ДНК ЦМВ, Cryptoccocus neoformans, РНК ВИЧ 1-го типа. Экстракцию ДНК/РНК из образцов цельной крови проводили при помощи набора реагентов «Рибо–преп» (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора), экстракцию РНК/ ДНК из образцов плазмы крови, СМЖ осуществляли с использованием набора реагентов и автоматической станции для выделения нуклеиновых кислот «NucliSENS® easyMAGTM» («bioMerieux», Франция) согласно инструкциям производителей. Амплификацию проводили с использованием наборов реагентов «АмплиСенс® Toxoplasma gondii–FL», «АмплиСенс® Cryptococcusneoformans–FL», «АмплиСенс® VZV–FL», «АмплиСенс® CMV–скрин–монитор–FL», «АмплиСенс® ВИЧ–монитор–FRT» (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме реального времени «Rotor–Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия) в соответствии с инструкцией производителя.

Иммунологические исследования плазмы крови выполняли методом твердофазного ИФА с выявлением специфических антител классов IgM, IgG к антигенам Varicella–Zoster virus, Т.gondii, используя наборы реагентов «VARICELLA IgM», «VARICELLA IgG» и «Toxoplasma IgM», «Toxoplasma IgG» («БХМ Диагностикс», США). Постановку ИФА, последующий анализ полученных результатов проводили, используя автоматический иммуноферментный анализатор «NexGen Four» («Adaltis Italia S.p.A», Италия), руководствуясь инструкцией производителя.

Сбор, хранение и транспортировку клинического материала проводили согласно МУ «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности» [6].

Результаты и обсуждение

При обследовании 96 больных установлено, что вирусная нагрузка РНК ВИЧ варьировала от недетектируемого уровня до >1,0•107 копий/мл в плазме крови и до 6,15•106 копий/мл в СМЖ. Уровень содержания СD4+-лимфоцитов – от 3 до 944 клеток/мкл (медиана 120 клеток/мкл). При этом у 40 (41,7%) больных вирусная нагрузка РНК ВИЧ в плазме крови составила >1,0•105 копий/мл, а в СМЖ – 370–6,1•106 копий/мл.

Критерии диагностики ВИЧ-ассоциированных состояний рассматриваются с учетом степени иммунодефицита у конкретного пациента [7]. В зависимости от количества СD4+-лимфоцитов (<200 клеток/мкл, 200–499 клеток/мкл, >500 клеток/мкл) все больные были разделены на 3 группы. Данный принцип разделения соответствует классификации Сеnters for Disease Control and Prevenion (США, 1993), согласно которой количество СD4+-лимфоцитов <200 клеток/мкл является иммунологическим критерием СПИДа [8]. Результаты нескольких когортных исследований показывают, что высокая вирусная нагрузка РНК ВИЧ в крови, особенно на поздних стадиях ВИЧ-инфекции, также служит независимым фактором риска оппортунистических заболеваний [7].

В 1-ю группу вошли 65 (67,7%) больных, у которых количество СD4+-лимфоцитов составило <200 клеток/мкл (медиана 67 клеток/мкл). РНК ВИЧ в крови определяли в концентрации 123–4,01•106 копий/мл, СМЖ – 366–6,15•106 копий/мл.

2-ю группу составили 24 (25%) пациента, с количеством СD4+-лимфоцитов 200–499 клеток/мкл (медиана 312 клеток/мкл). РНК ВИЧ в крови выявляли в концентрации 1,58•103–7,74•105 копий/мл, СМЖ – 122–1,43•105 копий/мл.

3-я группа – 7 (7,3%) пациентов, количество CD4+-лимфоцитов у которых составило 500–944 клеток/мкл (медиана 610 клеток/мкл). РНК ВИЧ в крови выявляли в концентрации от недетектируемого значения до 1,0•104 копий/мл, СМЖ – от недетектируемого значения до 6,94•104 копий/мл. Оппортунистические инфекции ЦНС у больных данной группы не регистрировались.

Установлено, что во многих случаях знание текущего количества СD4+-лимфоцитов у пациентов с ВИЧ-инфекцией позволяет практически исключить ряд оппортунистический инфекций из диагностического поиска. Так, развитие церебрального токсоплазмоза, криптококкоза, милиарного туберкулеза при количестве CD4+-лимфоцитов >100 клеток/мкл, а пневмоцистной пневмонии, кандидозного эзофагита, прогрессирующей многоочаговой лейкоэнцефалопатии и герпеса при >250 клеток/мкл возможно, но лишь как редкое исключение [2].

При проведении этиологической диагностики оппортунистических инфекций ЦНС у всех обследованных пациентов (96 человек) в 1-й и 2-й группах были получены следующие результаты. ДНК T. gondii в СМЖ была выявлена у 3 (3,1%) больных 1-й группы (количество CD4+-лимфоцитов составило 5–150 клеток/мкл). Диагноз «токсоплазмозный энцефалит» был поставлен на основании клинической картины энцефалита, обнаружения характерных очагов поражения головного мозга (по данным МРТ) и нормализации клинического состояния пациента с исчезновением или уменьшением церебральных очагов (по данным контрольной МРТ) на фоне этиотропного лечения бисептолом или фансидаром согласно «Методическим рекомендациям по вопросам профилактики и лечения вторичных заболеваний у взрослых и подростков, больных ВИЧ-инфекцией» [1]. В одном из представленных случаев у пациента с содержанием CD4+-лимфоцитов 5 клеток/мкл была обнаружена только ДНК T. gondii методом ПЦР в СМЖ, специфические антитела классов IgM, IgG к антигенам T. gondii методом ИФА в крови не выявили. Впоследствии проведенное патологоанатомическое исследование подтвердило диагноз «генерализованный токсоплазмоз с поражением головного мозга» у данного пациента. У остальных двух больных одновременно с обнаружением ДНК T. gondii в СМЖ выявили только специфические IgG в крови. Следует отметить, что повышение уровня специфических антител класса IgG, выявление специфических антител класса IgМ в крови у пациентов данной группы наблюдается крайне редко [9].

ДНК C. neoformans у больных 1-й группы выявили в СМЖ в 4 (4,2%) случаях. Количество СD4+-лимфоцитов составило от 9 до 116 клеток/мкл. Концентрация ДНК C. neoformans в СМЖ – 200–1,07•105 копий/мл. Диагноз «криптококковый менингоэнцефалит» у данных больных впоследствии был подтвержден при патологоанатомическом исследовании. При проведении бактериологического исследования C. neoformans идентифицирован только в одном случае (до назначения специфической терапии). При помощи микроскопического исследования ни в одном случае C. neoformans в СМЖ не был выявлен. Несмотря на то что основными методами лабораторной диагностики криптококкоза являются микроскопия, выделение C. neoformans в культуре клеток для этиологической верификации церебрального криптококкоза, метод ПЦР зарекомендовал себя как более чувствительный.

ДНК ЦМВ с концентрацией в плазме >103 копий/ мл (1,5•103–5,7•103 копий/мл) определили у 3 (3,1%) пациентов 1-й группы. В СМЖ ДНК ЦМВ выявили только в одном случае (1,5•102 копий/мл). Количество СD4+-лимфоцитов составило <20 клеток/мкл. Проведенные позднее патологоанатомические исследования подтвердили диагноз «манифестная цитомегаловирусная инфекция» у всех ранее обследованных больных. Следует отметить, что в лабораторной диагностике цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) у пациентов с ВИЧ-инфекцией наиболее информативно использование количественного определения ДНК ЦМВ методом ПЦР. Появление и постепенное увеличение концентрации ДНК ЦМВ в крови существенно опережает развитие клинической симптоматики [10]. При этом чем выше показатели количества ДНК ЦМВ в крови, тем выше риск клинически выраженной инфекции [11]. Показано, что наиболее специфичным и чувствительным лабораторным маркером развития манифестной ЦМВИ у пациентов с ВИЧ-инфекцией является выявление в лейкоцитах крови ДНК ЦМВ в концентрации 1:1000 на 105 клеток и более [12] или >103 копий/мл в плазме крови [11]. Иммунологические исследования при диагностике ЦМВИ у пациентов с ВИЧ-инфекцией в большинстве случаев неинформативны, что в первую очередь обусловлено дефектом иммунной системы у пациентов данной категории [2, 10].

ДНК Varicella–Zoster virus выявлена у пяти (5,2%) больных: двух из 1-й группы и трех из 2-й. У двух пациентов 1-й группы (количество CD4+-лимфоцитов <150 клеток/мкл) с клиническим диагнозом «менингоэнцефалит неизвестной этиологии» высыпаний не наблюдали, ДНК Varicella–Zoster virus определили только в СМЖ; в крови вирусоспецифические антитела класса IgМ не обнаружили, IgG выявляли у всех. У трех больных 2-й группы (количество СD4+-лимфоцитов >200 клеток/мкл) с клиническим диагнозом «опоясывающий лишай» ДНК Varicella–Zoster virus обнаружили в периферической крови и СМЖ. Специфические антитела класса IgG к антигенам Varicella–Zoster virus выявили в крови у всех, а IgМ – только у одного пациента. Установлено, что опоясывающий лишай развивается в результате реактивации латентной инфекции, вызванной Varicella–Zoster virus. У ВИЧ-инфицированных рецидивы возможны даже при количестве CD4+-лимфоцитов >1000 клеток/мкл [2]. В типичных случаях течения заболевания диагностика не представляет трудности и основывается на клинико-эпидемиологических данных. При атипичном течении для верификации диагноза используют лабораторные методы исследования. Неврологические осложнения (менингоэнцефалит, миелит, поражение черепных нервов), вызванные Varicella–Zoster virus, можно диагностировать только при исследовании СМЖ с помощью ПЦР [2, 7]. Использование метода ПЦР при исследовании периферической крови и СМЖ повышает эффективность этиологической диагностики поражений ЦНС, вызванных Varicella–Zoster virus, у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

В ходе проведенного исследования установлено, что частота выявления ДНК возбудителей оппортунистических инфекций ЦНС у пациентов с ВИЧ-инфекцией в зависимости от степени иммунодефицита составила в 1-й группе (количество СD4+-лимфоцитов <200 клеток/мкл) 12,5%, во 2-й (200–499 клеток/мкл) – 3%. Оппортунистические инфекции ЦНС в 3-й группе (>500 клеток/мкл) не регистрировались.

Выявление ДНК Т. gondii (3,1%) и С. neoformans (4,2%) в СМЖ в 100% случаев позволило лабораторно подтвердить диагнозы «токсоплазмозный энцефалит» и «криптококковый менингоэнцефалит» соответственно. Использование иммунологических методов, направленных на определение специфических антител классов IgМ, IgG к антигенам Т. gondii, при содержании СD4+-лимфоцитов <150 клеток/мкл имеет низкое диагностическое значение по сравнению с ПЦР. При диагностике церебрального криптококкоза метод ПЦР зарекомендовал себя как более чувствительный относительно бактериологического исследования и микроскопии.

Количественное определение ДНК ЦМВ в периферической крови является высокоспецифичным маркером развития манифестной инфекции.

Обнаружение ДНК Varicella–Zoster virus (5,2%) в периферической крови и СМЖ являлось более информативным показателем при прогнозировании развития инфекционною процесса, чем традиционно применяемые иммунологические методы.

Таким образом, использование метода ПЦР при одновременном исследовании периферической крови и СМЖ повышает эффективность этиологической диагностики поражений ЦНС у пациентов с ВИЧ-инфекцией. Представленное исследование подтверждает высокую специфичность метода ПЦР при дифференциальной диагностике оппортунистических инфекций ЦНС.