Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) остается одной из актуальных проблем современной медицины в связи с сохраняющейся высокой заболеваемостью, нередко тяжелым течением и отсутствием эффективной этиотропной терапии. Концепция о ведущей роли иммунных реакций в патогенезе вирусных инфекций получила всеобщее признание. Особенности взаимоотношений вируса и иммунной системы определяют тяжесть течения заболевания и его исход [1]. В патогенезе ГЛПС иммунные механизмы занимают одно из ведущих мест, следовательно, лечение ГЛПС должно быть комплексным, затрагивающим все звенья патогенеза, в том числе и иммунологические. В связи с этим представляет интерес клинико-иммунологическая оценка эффективности имунофана — препарата с доказанной иммуномодулирующей активностью — в лечении тяжелых и среднетяжелых форм ГЛПС.

Отсутствие побочных эффектов и токсичности, четко продемонстрированное в экспериментальных и клинических исследованиях [2—5], указывает на возможность применения имунофана в качестве лечебного и профилактического средства при инфекционных заболеваниях как бактериального, так и вирусного генеза.

Целью настоящего исследования явилось изучение эффективности применения иммуномодулятора имунофана в комплексной терапии ГЛПС различной степени тяжести.

Материалы и методы

В исследование включили 135 больных, находившихся на стационарном лечении в МУ Городская клиническая больница № 13 Уфы с серологически подтвержденным методом непрямых флюоресцирующих антител диагнозом ГЛПС, из них 119 мужчин (82,1%) и 26 женщин (17,9%). Возраст обследованных колебался от 18 до 55 лет, средний возраст составил 37,4±2,6 года. Из исследования исключали тех лиц, у которых до заболевания ГЛПС имелись болезни почек, печени, сердечно-сосудистой системы, нервной системы, эндокринологические и онкологические заболевания. При определении степени тяжести заболевания использовали классификацию Б.З. Сиротина [6]. Среднетяжелая форма выявлена у 73 больных (50,3%), тяжелая — у 62 больных (49,7%). Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту.

Методика определения концентрации цитокинов в сыворотке крови

Кровь для исследования брали из локтевой вены утром натощак в объеме 9 мл. Кровь центрифугировали для отделения сыворотки от клеточных элементов и сразу замораживали. Пробы хранили при -20°С до момента исследования. Для определения концентрации цитокинов (ИНФ-γ, ФНО-α, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10) использовали наборы реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Уровень цитокинов определяли иммуноферментным методом в соответствии с инструкцией производителя. Метод определения основан на «сандвич-варианте» твердофазного иммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональных антител.

Методика определения субпопуляционного состава лимфоцитов крови

Забор крови осуществлялся в мерные силиконированные пробирки с антикоагулянтом (2,6% раствор динатриевой соли ЭДТА) из локтевой вены утром натощак. Иммунофенотипирование клеток периферической крови осуществлялось методом прямой иммунофлюоресценции с помощью проточного цитофлюориметра FACS Calibur (фирма Becton Dickinson, США) c помощью реагентов
фирмы Becton Dickinson с характеристикой основных маркеров иммунокомпетентных клеток (CD3+,
CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD25+, иммунорегуляторный индекс CD4/CD8).

Методика исследования хемилюминесценции цельной крови

Венозную кровь отбирали в пластиковую пробирку (в стеклянной активируется дыхательный взрыв фагоцитов), содержащую раствор гепарина. Регистрацию свечения проводили на хемилюминометре ХЛМ-003. В качестве наиболее информативных показателей хемилюминесценции были взяты светосумма спонтанная и стимулированная (S и S ) и максимальная амплитуда медленной вспышки — I.

Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием стандартного статистического пакета программ Statistica 7.0 for Windows. Среднее значение М и ошибку среднего значения m вычисляли в Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Данные первичного обследования больных ГЛПС среднетяжелой и тяжелой формы приведены в табл. 1. Обследование проводили в разгар заболевания (в олигурический период) и перед выпиской из стационара (в полиурический период). Как видно из табл. 1, изменения иммунологических параметров у больных обеих групп однотипны. В период максимально выраженных клинических проявлений (олигоанурический) наблюдали статистически значимое снижение числа общих Т-лимфоцитов (СD3+) и Т-хелперов/индукторов (СD4+). Также отмечали достоверное снижение иммунорегуляторного индекса по сравнению с контрольной группой, происходящее на фоне активации В-клеточного звена иммунитета (СD19+) и увеличения числа натуральных киллеров (СD16+, СD56+). В период полиурии общее число Т-лимфоцитов (СD3+) повышается, так же как и Т-хелперов (СD4+), однако остается достоверно ниже, чем у здоровых людей. Таким образом, изменения субпопуляционного состава лимфоцитов у больных ГЛПС зависят от степени тяжести и периода заболевания. Наиболее выраженный Т-клеточный дефицит отмечали в олигурический период тяжелой формы ГЛПС.
Далее мы изучали состояние функциональной активности фагоцитов путем регистрации спонтанного и индуцированного зимозаном люминолзависимого свечения цельной крови у больных ГЛПС в различные периоды заболевания.

В олигурическом периоде у больных ГЛПС среднетяжелой и тяжелой формы отмечали достоверное
повышение генерации активных форм кислорода, что проявлялось в увеличении светосуммы и величины пика спонтанной хемилюминесценции цельной крови. При этом индекс индукции снижался.
В разгар заболевания (олигурический период) было выявлено наиболее выраженное падение емкости
резерва функциональной активности фагоцитов, особенно при тяжелой форме ГЛПС.

В полиурическом периоде отмечали снижение светосуммы и максимальной амплитуды медленной вспышки спонтанной и индуцированной хемилюминесценции при среднетяжелой и тяжелой форме ГЛПС. При этом индекс индукции повышался. Емкость резерва функциональной активности фагоцитов в полиурическом периоде повышалась, но оставалась достоверно ниже, чем в контрольной группе (р<0,01), особенно при тяжелой форме ГЛПС.

Таблица 1. Иммунный статус больных со среднетяжелой и тяжелой формой ГЛПС, получавших
стандартную терапию (М±m).

Исследование уровней цитокинов в сыворотке крови больных ГЛПС, ассоциированной с серотипом Puumala, выявило значительный дисбаланс цитокинов. Отмечено выраженное повышение содержания провоспалительного цитокина ФНО-α в олигурическом периоде как при среднетяжелой (р<0,001), так и при тяжелой форме ГЛПС (р<0,001). В период полиурии содержание ФНО-α уменьшалось, оставаясь значительно выше, чем в контрольной группе, при среднетяжелой форме и при тяжелой форме.

Анализ содержания провоспалительного цитокина ИНФ-γ выявил совершенно другую динамику: отмечали снижение ИНФ-γ в олигурический период как при среднетяжелой (р<0,01), так и при
тяжелой форме ГЛПС. В период полиурии продукция ИНФ-γ несколько повышалась при среднетяжелой форме и практически не изменялась при тяжелой форме. Снижение продукции ИНФ-γ указывает на сниженную активность Т-хелперов и ЕК-клеток, продуцирующих данный цитокин, либо на угнетение продукции ИНФ-γ вирусом ГЛПС, в то же время низкие концентрации ИНФ-γ могут объясняться как его преимущественным содержанием в тканях, так и усиленным использованием и быстрым разрушением. Наиболее низкие уровни ИНФ-γ были выявлены при острой почечной недостаточности.

Таким образом, снижение продукции ИНФ-γ уже в лихорадочный период представляет реальную угрозу в плане неконтролируемой репликации вируса и развития более тяжелой формы ГЛПС.
Анализируя уровень ИЛ-2, важного медиатора иммунитета, особенно клеточного, мы выявили
достоверное снижение его в олигурический период как при среднетяжелой (6,13±0,3 пг/мл, р<0,05), так и при тяжелой форме ГЛПС (4,07±0,5 пг/мл, р<0,01). В полиурическом периоде концентрация ИЛ-2
у больных ГЛПС оставалась достоверно ниже, чем в контрольной группе, несмотря на то, что отмечалось повышение его уровня как при среднетяжелой ( 6,51±0,24 пг/мл, р<0,05), так и при тяжелой форме ГЛПС (5,14±0,31 пг/мл, р<0,01). Основным биологическим эффектом ИЛ-2 является стимуляция пролиферации Т- и ЕК-клеток. Следовательно, низкий уровень ИЛ-2 является одним из факторов снижения СD3+ и СD16+ в разгар ГЛПС, что было выявлено ранее.

Анализ содержания противовоспалительного цитокина ИЛ-4 в сыворотке крови больных ГЛПС
выявил отличную от ФНО-α и ИНФ-γ динамику. В олигурический период выявлено нарастание
уровня ИЛ-4 как при среднетяжелой, так и при тяжелой форме ГЛПС. В период полиурии отмечали дальнейшее увеличение синтеза ИЛ-4 при среднетяжелой и тяжелой формах. Данный цитокин оказывает противовоспалительное действие, подавляя функции макрофагов и секрецию ими провоспалительных цитокинов. Возможно, с этим связан дефицит ИНФ-γ, более выраженный у больных с тяжелой формой ГЛПС. Кроме того, повышение уровня ИЛ-4 в период полиурии способствует снижению активности провоспалительного цитокина ФНО-α и ограничению воспалительного процесса.

Анализ содержания противовоспалительного цитокина ИЛ-1 в различные периоды ГЛПС выявил общую с противовоспалительным цитокином ИЛ-4 динамику. Было выявлено достоверное повышение уровня ИЛ-10 в олигурический период как при среднетяжелой, так и при тяжелой форме ГЛПС. В период полиурии, несмотря на снижение уровня ИЛ-10, его концентрация оставалась достоверно выше, чем в контрольной группе.

Таким образом, у всех больных ГЛПС тяжелой и среднетяжелой формы в разгар заболевания
отмечали Т-клеточный дефицит, выражающийся снижением СD3+, СD4+ и иммунорегуляторного индекса, значительный дисбаланс цитокинов, выражающийся в резком повышении ФНО-α, монотонно низком уровне ИНФ-γ, снижении ИЛ-2 в олигурическом периоде и высоком уровне противовоспалительных цитокинов в олигурическом и полиурическом периодах. В разгар заболевания было выявлено выраженное падение емкости резерва функциональной активности фагоцитов, особенно при тяжелой форме ГЛПС.

Выявленные нарушения иммунного статуса явились основанием для проведения иммунокорригирующей терапии у больных со среднетяжелым и тяжелым течением ГЛПС.

Имунофан назначали в дозе 50 мкг/мл внутримышечно 1 раз в сутки, через день № 5, в течение
10 дней, начиная с олигурического периода, после предварительного получения письменного информированного согласия больного на проведение терапии данным препаратом.

Для оценки эффективности назначения имунофана в качестве патогенетической и иммунокорригирующей терапии все больные были разделены на 2 группы. Больные контрольной группы получали общепринятую терапию, а пациентам основной группы, помимо общепринятой терапии, назначали имунофан. В исследование были включены больные со среднетяжелой и тяжелой
формой заболевания. При определении степени тяжести заболевания использовали классификацию Б.З. Сиротина [4].

В качестве критериев эффективности фармакотерапевтического воздействия имунофана нами
использованы следующие показатели:
1) клинические — длительность лихорадки, болевого синдрома, продолжительность олигурии
и протеинурии;
2) биохимические — пиковые уровни мочевины и креатинина;
3) иммунологические — субпопуляционный состав лимфоцитов крови, определение цитокинового профиля, емкости резерва фагоцитов и индекса индукции фагоцитов в динамике заболевания.

Результаты лечения 73 больных со среднетяжелой формой ГЛПС в двух сравниваемых группах
представлены в табл. 2. Выявлены различия в продолжительности лихорадочного периода. Средняя
длительность лихорадки у больных, принимавших имунофан, составила 5,9±0,9 дня, а в контрольной группе — 9,5±0,35 дня (р<0,01). Олигурия (количество мочи меньше 600 мл в сутки) имела место в обеих группах со среднетяжелым течением. Однако длительность олигурии у больных, получавших имунофан, была достоверно меньше (2,5±0,23 против 4,3±0,3 дня, р<0,05). Длительность болевого синдрома (головная боль, боль в животе, боль в пояснице) также имела значимые различия в обеих группах.

Таблица 2. Клинические критерии эффективности применения имунофана у больных со среднетяжелой и тяжелой формой ГЛПС (М±m).

Признаки гиперазотемии наблюдали у 97% больных, степень ее была достаточно высокой (мочевина — от 12 до 25 ммоль/л, креатинин — от 130 до 500 мкмоль/л). Пиковые уровни этих показателей в группах достоверно различались (табл. 3). Результаты изучения иммунологических показателей при среднетяжелой форме ГЛПС в группе с включением в комплексную терапию имунофана и в группе больных, получавших только базисную терапию, представлены в табл. 4.

Таблица 3. Пиковые показатели креатинина и мочевины в крови больных со среднетяжелой
и тяжелой формой ГЛПС в зависимости от метода лечения (М±m).

Таблица 4. Иммунный статус больных со среднетяжелой формой ГЛПС на фоне комплексной терапии
с включением имунофана (М±m).

У больных со среднетяжелой формой ГЛПС, получавших комплексное лечение с включением имуно-
фана, в ходе иммунологического мониторинга была выявлена положительная динамика показателей
иммунограммы. Так, на фоне применения имунофана отмечали рост показателей неспецифической
резистентности: достоверно увеличивалась емкость резерва фагоцитов и повышался индекс индукции,
который после лечения имунофаном не отличался от такового у здоровых лиц.

При сравнительной оценке показателей иммуно-фенотипирования лимфоцитов до и после применения имунофана отмечали увеличение количества общих Т-лимфоцитов (СD3+), хелперов/индукторов (СD4+), иммунорегуляторного индекса.

Анализ динамики содержания цитокинов в сыворотке крови у больных со среднетяжелым течением ГЛПС на фоне применения имунофана выявил значительное снижение уровней ФНО-α, ИЛ-4, ИЛ-10 и повышение уровней ИНФ-γ и ИЛ-2 после проведения иммуномодулирующей терапии в сравнении с показателями у пациентов, не получавших регуляторный пептид (р<0,05).

Таким образом, назначение имунофана в комплексной терапии больных со среднетяжелой формой ГЛПС оказало положительное влияние на иммунитет, способствовало клиническому улучшению течения заболевания, что проявлялось в уменьшении длительности клинических проявлений и пиковых показателей мочевины и креатинина.

Выявив наличие положительного иммуномодулирующего эффекта имунофана в комплексном лечении больных со среднетяжелой формой ГЛПС, мы приступили к изучению клинико-иммунологической эффективности имунофана в комплексной терапии больных с тяжелой формой ГЛПС. Методика назначения и критерии эффективности фармакотерапевтического воздействия имунофана были такие же, как и при среднетяжелой форме заболевания.

Результаты исследований основных клинических симптомов 62 пациентов с тяжелой формой ГЛПС в двух сравниваемых группах представлены в табл. 2.

Лихорадочный период в основной группе был достоверно меньше, чем в контрольной (р<0,01).
В олигурическом периоде усиливались боли в пояснице, животе, часто отмечали многократную рвоту, икоту. Суточный диурез снижался(менее 500 мл в сутки), вплоть до полной анурии (5 пациентов контрольной группы). Длительность олигурического периода у больных, получавших в комплексной терапии имунофан, составила 5,2±0,6 дня, а в контрольной группе —7,2±0,2 дня (р<0,05).

Болевой синдром у больных с тяжелой форм ГЛПС характеризовался большей длительностью и интенсивностью, чем при среднетяжелой форме.

Продолжительность болей в пояснице и в животе в основной группе была статистически меньше,
чем в контрольной группе. Продолжительность головной боли не имела достоверных различий.

Степень азотемии у больных с тяжелой формой была высокой. Значения креатинина от 400 до 700
ммоль/л выявлены у 65% пациентов контрольной группы и у 82% пациентов основной группы.
Пиковые уровни креатинина и мочевины имели статистические значимые различия в обеих группах ( см. табл. 3).

Результаты исследования иммунологических показателей при тяжелой форме ГЛПС в группе с включением в комплексную терапию имунофана и в группе больных, которым проводили только
базисную терапию, представлены в табл. 5.

Таблица 5. Иммунный статус больных с тяжелой формой ГЛПС на фоне комплексной терапии
с включением имунофана (М±m).

У больных с тяжелой формой ГЛПС, получавших комплексное лечение с включением имунофана, была выявлена положительная динамика показателей иммунитета: значительно увеличивалась емкость функционального резерва фагоцитов и достоверно повышался индекс индукции. Статистически достоверно увеличивались количество общих Т-лимфоцитов (СD3+), хелперов/индукторов (СD4+), иммунорегуляторный индекс, причем эти показатели приближались к уровню у здоровых лиц.

Анализ динамики содержания цитокинов в сыворотке крови у больных с тяжелым течением ГЛПС
на фоне применения имунофана выявил снижение уровней ФНО-α, ИЛ-4, ИЛ-10 и повышение уровней ИНФ-γ и ИЛ-2, различие между подгруппами было статистически достоверно.

Таким образом, глубокие изменения иммунного статуса больных со среднетяжелой и тяжелой формой ГЛПС, положительная клинико-иммунологическая динамика на фоне лечения имунофаном свидетельствуют о целесообразности применения препарата в комплексной терапии больных со среднетяжелым и тяжелым течением ГЛПС.