Гепатит С (ГС) – инфекционное заболевание, вызываемое парентерально передающимся вирусом ГС (ВГС). Отличительная особенность данного вируса – его способность часто вызывать развитие хронической формы инфекции. В нашей стране доля лиц, имеющих антитела к ВГС, по оценкам зарубежных эпидемиологов, составляет 3,1–4,0% [1, 2]. Отечественные эксперты оценивают количество инфицированных лиц в 4,2 млн чел., что соответствует 2,9% [3]. С 2001 г. в нашей стране наблюдается стабильное снижение заболеваемости острым (ОГС), а с 2009 г. – хроническим ГС (ХГС) [4]. В 2020 г. среди впервые зарегистрированных случаев хронических вирусных гепатитов первое место занял ХГС – 24,5 тысячи случаев. В 2021 г. заболеваемость гепатитом С составила 27,8 случая на 100 тыс. населения, что в 1,47 раза меньше чем в 2009 г. [5].

В большинстве случаев ОГС протекает бессимптомно и с частотой около 70–85% завершается развитием ХГС, который также может иметь бессимптомное течение в начальном периоде болезни. Если у пациента не выявлен ГС и не проводилась специфическая терапия, поражение печени постепенно прогрессирует и может завершиться развитием цирроза печени (ЦП) у 30% пациентов и у 5% – первичной гепатоклеточной карциномы (ГКК).

С 2011 г. началась принципиально новая терапия ГС – препаратами прямого противовирусного действия (ПППД). Эффективность лечения различными комбинациями ПППД очень высока, более 95% [6, 7]. Успехи новых схем терапии позволили ВОЗ объявить возможность снижения к 2030 г. на 90% числа случаев инфицирования ВГС, на 65% снизить смертность и прогнозировать охват новой терапией 80% больных людей [8]. Однако у пациентов, достигших устойчивого вирусологического ответа (УВО) после лечения ПППД, сохраняется риск повторного заражения, развития скрытой (оккультной) формы инфекции и ГКК [9–11]. По данным ВОЗ, даже после внедрения новой терапии ежегодно в мире умирают около 300 000 больных ХГС, в основном из-за ЦП и ГКК [8]. Профилактическая вакцина от ГС пока не разработана.

Установлена зависимость эффективности противовирусной терапии от степени поражения печени [12]. Чем меньше стадия фиброза печени (ФП), тем с большей вероятностью достигается УВО. Оценку стадии ФП в настоящее время чаще всего выполняют неинвазивными методами: транзиентной или магнитно-резонансной фиброэластометрией и различными вариантами анализа сывороточных биомаркеров [13].

Известно, что вероятность самопроизвольной элиминации вируса в острой фазе болезни ассоциирована с генотипом СС в полиморфной области гена IFNL4 (rs12979860 C/T) [14]. Пациенты, имеющие этот генотип, часто успешно завершают лечение при некоторых вариантах ПВТ [15, 16]. Установлено, что эта полиморфная область гена влияет на продукцию относительно недавно открытого интерферона-λ3, который вовлечен в цепь событий, приводящих к элиминации ВГС, и, возможно, оказывает влияние на скорость поражения печени при ХГС [17]. Однонуклеотидные вариации генов IFNL3 и IFNL4 в полиморфных локусах rs8099917 T/G и rs12979860 C/T влияют на стабильность матричной РНК, с которой транслируется интерферон-λ3, и на его содержание в крови [18].

Цель исследования – изучение возможной связи между отдельными стадиями ФП у пациентов и их вирусологическими, иммунологическими и иммуногенетическими показателями.

Материалы и методы

В исследовании участвовали 150 пациентов с ХГС (до начала терапии) в возрасте 18–60 лет: 81 (54%) мужчина и 69 (46%) женщин. Все участники не имели ВИЧ-инфекции, онкологических и гематологических заболеваний и гепатита, вызванного другими этиологическими агентами. Проведение данного исследования было одобрено этическим комитетом Российской медицинской академии непрерывного профессионального образования (протокол №7 от 17.05.2016 г.), были получены информированные согласия пациентов на обработку их данных и проведение исследований крови. Для сравнительного анализа генетических данных была сформирована группа сравнения, которую составили 150 здоровых добровольцев. Время сбора образцов – с 2016 по 2021 г.

Транзиентную фиброэластометрию выполняли на приборе Fibroscan FS 502 (Echosens, Франция). Для оценки степени выраженности фиброза была использована шкала METAVIR. По результатам анализа участники были разделены на 5 групп по 30 чел.: 1-я – без фиброза (F0), 2-я – с фиброзом в стадии F1, 3-я – в стадии F2, 4-я – в стадии F3 и 5-я – в стадии F4.

Обнаружение РНК ВГС и ее количественную оценку проводили высокочувствительным методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), используя набор реагентов «РеалБест РНК HCV», качественный и количественный вариант («Вектор-Бест», Россия).

Генотипирование ВГС выполняли методом ОТ-ПЦР с системой специфических праймеров или методом автоматического секвенирования зон генома 5’-NTR-core, NS5B, используя секвенатор 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems/Hitachi, Япония) [19, 20].

Антитела к антигенам ВГС выявляли иммуноферментным методом в сертифицированных тест-системах «РекомбиБест анти-ВГС IgM» и «РекомбиБест анти-ВГС-спектр» («Вектор-Бест», Россия), характеристика которых описана ранее [21].

Генотипы пациентов по полиморфным локусам генов IFNL3 (rs12979860 С/T) и IFNL4 (rs8099917 T/G) устанавливали методом ПЦР в режиме реального времени, используя набор реагентов «Иммуногенетика IL28B» и детектирующий амплификатор «ДТлайт» («ДНК-технология», Россия).

Статистическую обработку выполняли, используя пакет программ Statistica 10.0 (StatSoft Inc., Tulsa, США). Количественные показатели в группах пациентов представляли как среднее арифметическое или геометрическое ± двойная стандартная ошибка среднего. Тест на нормальность распределения выполняли, используя описательную статистику (normal probability plot). При наличии нормального распределения для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента, в иных случаях применяли критерий χ2 (при необходимости с поправкой Йейтса) и точный метод Фишера. Корреляцию признаков оценивали методом Спирмена. Различия между сравниваемыми величинами (признаками) признавали статистически достоверными при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

В анализируемых группах доля мужчин постепенно увеличивалась от 1-й к последней (46,7% против 60,3%; р > 0,05). Различия в длительности заболевания между группами колебались в пределах от 4,15 до 5,85 года. Активности АЛТ и АСТ постепенно нарастали от 1-й группы к последней (р > 0,05). Различия в доле пациентов с нормальными значениями печеночных ферментов между 1-й и последней группами достоверны (33,3% против 6,7%; р = 0,0211 и 36,7% против 6,7%; р = 0,0102 соответственно). Коэффициент корреляции Спирмена при сопоставлении стадий фиброза и доли участников с нормальными показателями АЛТ и АСТ по группам составил -0,9 (уровень значимости р < 0,05).

Данные по вирусной нагрузке (ВН) и частоте выявления отдельных субтипов ВГС в группах представлены в табл. 1. В группах со 2-й по 5-ю преобладали пациенты с ВН в диапазоне 105 МЕ/мл, только в группе без фиброза чаще выявляли пациентов с виремией в диапазоне 106 МЕ/мл. Наблюдается увеличение доли пациентов с виремией в диапазоне 105 МЕ/мл от 1-й группы к 5-й (р = 0,0201). Доля пациентов с виремией в диапазоне 104 МЕ/мл во всех группах была без существенных изменений, оценить колебание доли пациентов с виремией в диапазоне 107 МЕ/мл невозможно из-за наличия таких пациентов только в 3 последних группах.

Во всех группах доминировал ВГС субтипа 1b. В 1-й группе доля пациентов с ВГС субтипа 3а была близка к доле субтипа 1b (43,3 и 46,7%). Нарастание частоты обнаружения ВГС субтипа 3а от 1-й группы к последней было статистически недостоверно (р > 0,05). Надо отметить, что изменение структуры субтипов ВГС в группах отражает процесс распространения отдельных субтипов в Российской Федерации в течение последних 25 лет. Интенсивное проникновение и распространение ВГС субтипа 3а происходило в 1980–1990 гг. Постепенно этот субтип стал вытеснять лидирующий субтип 1b. В нашем исследовании в группе лиц, инфицированных около 25 лет назад (5-я группа), доминировал субтип 1b (66,7%). ВГС генотипа 1 часто обнаруживали у пациентов с ЦП, поэтому его считают ассоциированным с развитием цирроза [22, 23]. Однако и вирус генотипа 3 тоже рассматривают как неблагоприятный, так как с ним связано частое развитие стеатоза, что ускоряет фиброзирование печени [24, 25]. В нашем исследовании доля лиц, инфицированных ВГС субтипа 3а, была незначительна в группе участников с ЦП из-за невысокого содержания этого субтипа в популяции больных в 1990-е гг. [26]. В 2011–2014 гг. частота обнаружения субтипов 1b и 3а у инфицированных в Российской Федерации снижалась [27].

Результаты анализа специфических антител представлены в табл. 2. Выявлено нарастание титра анти-ВГС IgM от 1-й группы к последней, однако различия не имели статистической достоверности из-за значительных индивидуальных колебаний.

По мере увеличения стадии фиброза наблюдается нарастание моды (наиболее часто встречаемой величины) титра анти-ВГС IgM с 1:8 до 1:128. Только для анти-ВГС IgM обнаружено достоверное снижение (p < 0,001) количества пациентов, не имеющих этих антител, начиная с 3-й группы. Различия удельного веса пациентов без анти-ВГС IgM в 1-й и 5-й группах достоверны (р = 0,0001). Наличие анти-ВГС IgM и увеличение их титра ассоциировано с нарастанием стадии ФП (ρ = 0,9; р < 0,05). Поскольку анти-ВГС IgM образуются на новые антигенные детерминанты, очевидно, что мутации в вирусной РНК происходят чаще при высоких стадиях фиброза, которым соответствует большая длительность инфекции.

При сравнении среднегрупповых титров антител (IgG) к антигенам core, NS3, NS4ab, NS5a обнаружены легкие вариации и, в ряде случаев, их постепенное увеличение по мере нарастания стадии фиброза. Однако различия не достигли статистической достоверности, вероятно, из-за значительных индивидуальных колебаний в группах. Эти антитела не ассоциированы с увеличением стадий фиброза. Анти-core IgG и анти-NS3 IgG были обнаружены у всех участников, в отличие от антител к NS4ab и NS5a. Изменение доли участников, не имеющих анти-NS4ab IgG, от 1-й группы к 5-й статистически не достоверно (р < 0,05).

Известно, что однонуклеотидный полиморфизм генов IFNL3 (rs8099917 T/G) и IFNL4 (rs12979860 С/T) влияет на самопроизвольную элиминацию ВГС в случае острой инфекции и при некоторых видах ПВТ [14–16]. Можно предположить, что отдельные генотипы по полиморфным участкам этих генов будут чаще или реже встречаться у пациентов с различными стадиями фиброза. Генотипы пациентов по полиморфным локусам генов IFNL3 (rs8099917 T/G) и IFNL4 (rs12979860 С/T) в группах представлены в табл. 3.

От 1-й группы к 5-й постепенно снижается доля пациентов с генотипом СС/ТТ (rs12979860 и rs8099917). Вероятно, часть лиц с этим генотипом успешно завершили терапию (генотип благоприятствует достижению УВО), и поэтому их доля уменьшалась с увеличением стадии фиброза. Наряду с генотипом СС/ТТ постепенно снижалась доля генотипа СТ/ТТ, различия при сравнении 1-й и 5-й групп достоверны (p = 0,0211). Возможно, пациенты с этим генотипом тоже чаще достигают УВО. Но этот факт нуждается в изучении. От 1-й группы к 5-й увеличивалась доля лиц с генотипом CT/TG, различия при сравнении 1-й и 5-й групп достоверны (р = 0,0009). Этот генотип стал доминирующим в группе пациентов с ЦП. Очевидно, данный генотип можно рассматривать как прогностический маркер, свидетельствующий о повышенной вероятности развития ЦП у пациентов с ХГС.

Среди 150 больных ХГС лица с генотипом СС (rs12979860) составили 30%, что достоверно меньше, чем среди 150 здоровых участников (54%; р < 0,0001). Эта закономерность была обнаружена ранее [14]. По данным другого исследования1, среди 567 пациентов с ХГС (европеоиды), проживающих в Иркутской области, доля участников с генотипом СС составила 31,6%, что очень близко к значению, полученному в настоящем исследовании. Нами обнаружены различия по частоте встречаемости генотипа СТ/ТG у здоровых участников и пациентов с ХГС (p = 0,0026). Частота выявления генотипов СТ (rs12979860) и ТG (rs8099917) была достоверно выше у инфицированных (54 и 34% соответственно; р = 0,0001 и 0,0009). Близкие значения были получены при обследовании 567 пациентов с ХГС, проживающих в Иркутской области, – 54,5% (rs12979860 СТ) и 35,8% (rs8099917 ТG) [27]. В публикации К.В. Жданова и соавт. было проанализировано распределение аллельных пар тех же полиморфных зон генов IFNL3 и IFNL4 у пациентов с различными стадиями ФП [28]. Авторами показано доминирование генотипа ТG гена IFNL3 (rs8099917) у больных с ЦП. По другим генотипам данные не совпадали с результатами, полученными нами. Надо отметить, что у К.В. Жданова и соавт. [28] численность пациентов в группах имела сильные колебания (от 8 до 46 участников, n = 86). Вероятно, этим объясняется несовпадение с нашими данными. В другом исследовании [29], посвященном анализу генетических факторов, влияющих на скорость прогрессирования ФП у пациентов с ХГС в Японии (n = 176), было показано, что независимым предиктором быстропрогрессирующего ФП являются генотипы TG и GG гена IFNL3 (rs8099917), что совпадает с обнаруженной нами закономерностью – преобладанием варианта TG в группе пациентов с ЦП.

Заключение

В представленном исследовании изучена потенциально возможная взаимосвязь вирусологических, серологических и иммуногенетических факторов пациентов с отдельными стадиями ФП при ХГС. Сравнение вирусологических показателей не выявило достоверной связи с определенной стадией фиброза. Среди специфических антител только у анти-ВГС IgM обнаружена ассоциация с фиброзом F2–F4. Частота выявления этих антител достоверно увеличивалась от стадии F0 к F4. Соотношение вариантов генотипов по полиморфным локусам генов IFNL3 и IFNL4 менялось по мере возрастания ФП. Установлено, что прогностическими маркерами предстоящего ЦП являются высокие титры анти-ВГС IgM и генотип CT-TG в полиморфных локусах генов IFNL4 и IFNL3 (rs12979860 и rs8099917). Учитывая, что в мире отмечается рост численности больных ХГС в цирротической стадии, очевидна необходимость их раннего выявления и назначения терапии [30]. Научно-практическое значение данного исследования связано с развитием персонифицированной, прогностической и предиктивной медицины.