Микробиологический мониторинг штаммов Neisseria meningitidis является неотъемлемой частью эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией. В предыдущих исследованиях было показано, что периодические колебания показателя заболеваемости менингококковой инфекцией – чередование периодов эпидемического неблагополучия и межэпидемических периодов – могут быть связаны с присутствием на территории гипервирулентных штаммов менингококка [1, 2]. Изучение особенностей и закономерностей распространения гипервирулентных штаммов позволяет в ряде случаев контролировать эпидемический процесс с помощью различных типов вакцин. С этой целью разработана система обозначения штаммов N. meningitidis, позволяющая дифференцировать штаммы внутри вида и включающая характеристику серологических и генетических свойств бактерии. Основными регламентированными методами характеристики штаммов N. meningitidis являются серогруппирование в сочетании с мультилокусным секвенированием-типированием (МЛСТ) и антигенной характеристикой трех вариабельных фрагментов белков PorA и FetA [1, 3]. Применение метода МЛСТ позволяет проводить объединение генетически близких штаммов в группы – клональные комплексы. Полученная таким образом характеристика штамма в совокупности с эпидемиологической информацией (год, источник, территория) объединяется через Интернет в общедоступную базу данных http://pubmlst.org/neisseria/. Запрос в базу данных позволяет идентифицировать впервые выделенный штамм как новый, или как уже известный, или как штамм, входящий в известный клональный комплекс. Для известных клональных комплексов в ряде исследований показана связь с уровнем заболеваемости на разных территориях, что позволяет говорить об эпидемической опасности исследуемого штамма [1–3].

Заболеваемость генерализованными формами менингококковой инфекции (ГФМИ) в России не превышает 2 случаев на 100 тыс. населения, в то же время заболеваемость в регионах может существенно варьировать и достигать значений 7–8 на 100 тыс. населения [4]. В предыдущих исследованиях охарактеризованы штаммы N. meningitidis, циркулирующие на территории Москвы [5], для которой характерны невысокие показатели заболеваемости. С целью сбора информации о свойствах штаммов, циркулирующих на территории России, было издано информационное письмо № 01/9620-0-32 от 29.06.2010 «О взаимодействии территориальных органов и учреждений Роспотребнадзора с Референс-центром по мониторингу за бактериальными менингитами». В рамках организованной работы были получены штаммы и клинический материал из регионов России. Проведена генетическая характеристика N. meningitidis, вызвавших ГФМИ, с целью определения серологических и генетических особенностей и потенциальной эпидемической опасности циркулирующих штаммов.

Материалы и методы

Исследовано 34 культуры, изолированные из ликвора или крови, и 22 клинических образца (кровь, спинномозговая жидкость, аутопсийный материал). Штаммы и клинические образцы были получены от больных ГФМИ в различных регионах России и направлены в Референс-центр по мониторингу за бактериальными менингитами. Исследованный материал был собран в период с 2008 по 2012 г., 40 (71%) штаммов и клинических образцов было выделено в 2011 г. Идентификация и серогруппирование штаммов N. meningitidis, приготовление бактериальных смывов и выделение ДНК проведены с использованием стандартных лабораторных методик [5, 6]. Штаммы и клинический материал были исследованы с помощью наборов реагентов «АмплиСенс Neisseria spp., Haemophilus spp, Streptococcus spp.-EPh» и «АмплиСенс Neisseria meningitidis A, B, C-EPh» (Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора).

Генотипирование проводилось согласно требованиям Европейского общества по изучению менингококковой инфекции (European Meningococcal Disease Society, http://neisseria.org/nm/typing/). Характеристика штаммов и образцов включала в себя определение методом МЛСТ сиквенс-типа и антигенного профиля – фрагментов VR1 и VR2 белка PorA и аллеля VR белка FetA – с помощью секвенирования соответствующих фрагментов генома N. meningitidis [3, 5]. При обозначении номеров аллелей, сиквенс-типов и клональных комплексов использована номенклатура базы данных http://pubmlst.org/neisseria/. На момент окончания работы база данных содержала записи о более чем 20 000 типированных представителей рода Neisseria. Для бактерий вида N. meningitidis было описано 47 клональных комплексов.

Результаты и обсуждение

Проведено генотипирование 56 штаммов и образцов, содержащих ДНК N. meningitidis. Исследованный материал содержал менингококки преимущественно серогрупп B (31 образец) и С (20 образцов), серогруппы А и W-135 обнаруживались существенно реже (4 и 1 образец соответственно).

Результаты МЛСТ и антигенной характеристики вместе с дополнительной информацией об источнике, годе и месте выделения менингококка внесены в базу данных http://pubmlst.org/neisseria/. Образцам присвоены следующие идентификационные номера: 13150, 13151, 13167, 15021, 15028, 15037, 15652, 19165-19193, 19195-19206 и 19463-19470.

При проведении антигенной характеристики выявлено несколько новых, не описанных ранее аллелей в нуклеотидных последовательностях, кодирующих антигенные белки: аллель 22-30 фрагмента VR1 белка PorA и 2 аллеля F4-35 и F3-52 фрагмента VR белка FetA. Большинство исследованных образцов (34 или 61%) содержали менингококки с сиквенс-типами, которые были впервые найдены в данном исследовании. Выявлено 22 сиквенс-типа, образованных не встречающимися ранее комбинациями аллелей, и 10 сиквенс-типов, содержащих 1 (у 8 сиквенс-типов) или 2 (у 2 сиквенс-типов) аллеля, не описанных ранее.

Три образца, содержащие ДНК менингококков серогруппы А, входили в клональный комплекс «ST-1 complex/subgroup I/II», характерный для московских штаммов менингококков этой серогруппы, выделяемых в межэпидемический период [5], и один образец с уникальным аллельным и антигенным профилем, не характерным для штаммов этой серогруппы – «A: P1.5-1,10-27: F4-35: ST-7639 (-)». Однократное (в 2009 г.) выделение возбудителя с такими характеристиками не позволяет говорить о его повышенных вирулентных свойствах. Единственный образец, содержащий ДНК менингококка серогруппы W-135, имел сиквенс-тип и аллельный профиль, характерный для московских штаммов этой серогруппы – «W-135: P1.5,2: F1-1: ST-11 (cc11)». Небольшое количество образцов, содержащих менингококки серогрупп A и W-135, не позволяет с уверенностью говорить о генетических или антигенных особенностях менингококков этих серогрупп, циркулирующих на территории России.

Практически все сиквенс-типы (35) менингококков серогрупп В и С были выявлены однократно, за исключением ST-3346 (8 образцов), ST-8499 (4 образца), ST-6926 и ST-9407 (по 2 образца). Согласно содержащейся в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/ информации, 7 найденных сиквенс-типов у представителей этих серогрупп были выявлены ранее на территории других европейских стран (табл. 1). Сиквенс-типы ST-3346 и ST-18 (1 образец в этом исследовании) выявлялись неоднократно также и среди штаммов серогрупп В и С, выделенных на территории Москвы в предыдущие годы [5].

Таблица 1.

Хотя большинство сиквенс-типов (32 у 34 образцов), выявленных у менингококков серогрупп В и С, не выявлялись ранее на других территориях, примерно половина (24) образцов серогрупп В и С принадлежала четырем известным клональным комплексам: «ST-41/44 complex/Lineage 3» (11 образцов серогруппы С и 7 – серогруппы В), «ST-18 complex» (4 образца серогруппы В), «ST-226 complex» и «ST-37 complex» (по одному образцу серогруппы В). Сиквенс-типы и антигенные характеристики образцов, входящих в эти клональные комплексы, приведены в табл. 2. Все найденные профили, за исключением двух образцов с профилем «С: P1. 17,16-4: F2-9: ST-3346 (сс41/44)», были выявлены однократно. Согласно информации, представленной в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/, клональные комплексы «ST-41/44 complex/Lineage 3» и «ST-18 complex» объединяют штаммы, выделенные преимущественно от больных ГФМИ. Клональный комплекс «ST-41/44 complex/Lineage 3» объединяет более 2700 штаммов, выделенных, начиная с 1960 г., и распространенных по всему миру. Штаммы этого клонального комплекса были выделены практически во всех странах Западной Европы [1]. Клональный комплекс «ST-18 complex» содержит около 300 штаммов, выделенных на территории Европы в 1974–2012 гг. Таким образом, штаммы, входящие в эти клональные комплексы, не имеют существенных генетических отличий от штаммов, циркулирующих в Европе, и московских штаммов, описанных ранее [5].

Таблица 2.

* Жирным шрифтом выделены впервые выявленные сиквенс-типы.

Несмотря на то что остальные 22 сиквенс-типа менингококков серогрупп В и С (27 штаммов), не удается отнести к известным клональным комплексам, с помощью алгоритма кластеризации eBURST [7] среди них можно выделить группу из 9 генетически близких штаммов менингококков с сиквенс-типами ST-6926, ST-8499, ST-9396, ST-9400 и ST-9569 (табл. 3). Все эти сиквенс-типы принадлежали менингококкам серогруппы В, за исключением ST-6926 (серогруппы С). Использованный для заполнения последних трех столбцов в табл. 3 метод eBURST является инструментом, позволяющим объединять генетически близкие штаммы в один клональный комплекс на основании количества несовпадений в соответствующих аллельных профилях. Аллельные профили сиквенс-типов ST-6926, ST-8499, ST-9396, ST-9400 и ST-9569 совпадают друг с другом как минимум по четырем локусам и отличаются друг от друга по одному, двум или трем локусам аллельного профиля, что позволяет объединить их в один клональный комплекс. Сиквенс-тип ST-9396 обладает наибольшим количеством близких сиквенс-типов, имеющих минимальные отличия в аллельном профиле: 1 сиквенс-тип отличается от него по одному локусу аллельного профиля и 3 сиквенс-типа – по двум.

Таблица 3.

* Номера аллелей МЛСТ-локусов.

** Количество сиквенс-типов (аллельных профилей), с которым данный аллельный профиль не совпадает по одному (SLV), двум (DLV) и трем (SAT) локусам.

Таким образом, из 51 изученного штамма N. meningitidis серогрупп В и С 33 входят в пять клональных комплексов. Клональный комплекс «ST-41/44 complex/Lineage» объединяет 18 (35%) образцов, клональный комплекс «ST-18 complex» – 4 (8%) образца, клональные комплексы «ST-226 complex» и «ST-37 complex» содержат по 1 (по 2%) образцу. В клональный комплекс, пока не выделенный в базе данных http://pubmlst.org/neisseria/ и образованный сиквенс-типами, генетически близкими к ST-9396, входит 9 (18%) образцов. Остальные 17 сиквенс-типов (18 образцов или 35%) не удается включить в какой-либо клональный комплекс, что может быть связано как с недостаточным объемом анализируемой выборки штаммов для адекватного охвата наблюдаемой территории, так и с особенностями клональной структуры менингококков, циркулирующих на территории России. Одновременное присутствие нескольких клональных комплексов, а также выявление значительной доли штаммов, не объединенных в клональные комплексы, типично для спорадического характера заболеваемости. В то же время присутствие на наблюдаемой территории сиквенс-типов и клональных комплексов, встречающихся в странах Европы, не позволяет говорить о существенных генетических особенностях российских штаммов N. meningitidis.