Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) – зоонозная природно-очаговая инфекционная болезнь (код по МКБ-10 – А98.0), вызываемая вирусом Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ).

Вопросы вирусологии, классической и молекулярной эпидемиологии и профилактики КГЛ, а также заболеваемость и региональные эпидемиологические особенности КГЛ были рассмотрены в нашем предыдущем сообщении [1]. Показано, что в XXI веке активизировались старые и появились новые природные очаги КГЛ в Евразии, существенно возросла заболеваемость. В результате был накоплен большой массив данных по клинике КГЛ, появились и были внедрены новые методы диагностики, которые рассматриваются в этой статье. Поскольку результаты исследований, проведенных в России, хорошо известны читателю и доступны из других источников, в обзоре особое внимание уделено анализу англоязычной литературы, в частности публикаций, основанных на данных, полученных в ходе эпидемии КГЛ в Турции в 2002–2012 гг.

Клиника КГЛ

По имеющимся данным, у всех млекопитающих, кроме человека, инфекция ККГЛ протекает практически бессимптомно, выражаясь в невысокой транзиторной виремии с последующей выработкой специфических антител. Экспериментальное заражение овец может сопровождаться невысокой лихорадкой, коров – вялостью и снижением аппетита. Известным исключением является летальная инфекция ККГЛ у новорожденных мышей, то есть у особей с несформировавшимся иммунитетом [2, 3].

Предполагают, что не менее 80% случаев инфекции вирусом ККГЛ у человека также протекают бессимптомно [4]. Наличие в очагах иммунной прослойки населения, не перенесшего клинического заболевания КГЛ, очевидно свидетельствует в пользу этого предположения. Высочайший уровень виремии при клинических случаях КГЛ (см. ниже) показывает, что у части популяции может быть нарушен механизм, ограничивающий репликацию вируса ККГЛ в организме человека. Поиск вариантов генов/белков (генетических полиморфизмов), сочетающихся с существенно повышенной предрасположенностью к развитию КГЛ, пока безуспешен [5, 6].

В течении клинически выраженной КГЛ выделяют 4 периода: инкубационный (1–14 дней, чаще 3–7); предгеморрагический (1–7 дней); геморрагический (2–5 дней); реконвалесценция (начиная c 10–20-го дня заболевания) [3, 7, 8].

По мнению российских и зарубежных (в последние годы в первую очередь турецких) специалистов, в предгеморрагический период основными симптомами являются слабость, лихорадка, головная боль, миалгия, тошнота (все эти симптомы встречаются в 60–90% случаев); возможны диарея, катаральные явления, гиперемия склер, кожи лица, шеи и грудной клетки. На следующей стадии геморрагические проявления на коже варьируют от петехиальной сыпи до крупных гематом, возможны носовые кровотечения (15–50% случаев), кровавая рвота (7–35%), мелена (1–15%), кровохарканье (10%), гематурия (10–20%), кровоточивость десен (10%) [6, 8–11]. Следует подчеркнуть, что при налаженной системе эпидемиологического надзора и диагностики КГЛ в эндемичных регионах большинство больных госпитализируют в предгеморрагическом периоде, на 2–5-й день заболевания. Возможно поэтому, по последним данным, геморрагический синдром отмечался в Турции в 2004–2005 гг. только y 30–40% больных КГЛ, в 2006–2007 гг. – у 15–25% [12, 13].

Российские специалисты, опираясь на клинический опыт, накапливавшийся с 1945 г. [7, 8, 14], дополнительно к перечисленной выше симптоматике обращают внимание на брадикардию и гипотонию в предгеморрагическом и геморрагическом периодах; при тяжелом течении болезни с кровотечениями брадикардия сменяется тахикардией [15]. Наличие или отсутствие геморрагического синдрома составляет основу российской клинической классификации. В работах, опубликованных в ХХ веке, геморрагический синдром отмечался у 85–90% российских больных КГЛ [16]. Однако в 2005–2010 гг., как и в Турции, лишь около 40% случаев заболевания КГЛ в России протекало с геморрагическим синдромом, при этом только в 20% случаев имело место тяжелое течение заболевания [1, 17].

Статистически значимыми прогностическими факторами летального исхода является мелена и кровавая рвота [6, 9, 10]. Профузные кровотечения в брюшную полость, маточные кровотечения и интрацеребральные кровоизлияния сравнительно редки (1–2%), но являются наиболее неблагоприятными прогностическими признаками. В принципе возможно повреждение сосудов, питающих любой орган, поэтому геморрагические симптомы встречаются в разных, иногда необычных, сочетаниях, причем степень их выраженности определяет тяжесть и исход болезни.

Увеличение печени наблюдается у 15–40% больных, селезенки – у 10–20%, лимфоаденопатия – у 15–40%. У части (до 15%) больных отмечаются признаки поражения дыхательных путей, в тяжелых случаях сопровождающиеся интерстициальным отеком легких по типу острого респираторного дистресс-синдрома [18].

Турецкие специалисты, в отличие от отечественных, не отмечали серьезных осложнений на стадии реконвалесценции [19].

Тромбоцитопения, лейкопения, повышенный уровень АСТ, АЛТ, ЛДГ, КФК – типичные проявления КГЛ, встречающиеся в 65–95% случаев [12]. Нарушения системы свертывания крови при КГЛ отражаются в увеличении протромбинового времени (ПТВ), международного нормализованного отношения (МНО), активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), снижении концентрации фибриногена; другие показатели свертывания (белок S, D-димеры, антитромбин III) менее информативны [10, 20]. Имеет место активация системы комплемента, что может быть зарегистрировано по усиленному потреблению компонентов С3 и С4 [10, 19]. Пациенты с геморрагическим синдромом (тяжелое течение болезни) и без него (среднетяжелое) отличаются по ряду лабораторных показателей. Методом характеристических кривых (ROC) было показано, что для больных с геморрагическим синдромом типичны: число тромбоцитов ниже 90х109/л; гемоглобин < 135 г/л; ПТВ > 13 с; АЧТВ > 35 с; МНО > 1,0; АСТ > 120 МЕ/л; АЛТ > 70 МЕ/л; ЛДГ > 510 МЕ/л; КФК > 270 МЕ/л; С-реактивный белок > 6 мг/л. Многофакторный анализ логистической регрессии показал, что независимыми маркерами развития геморрагического синдрома являются снижение числа тромбоцитов и уровня гемоглобина, повышение величины МНО, концентраций АСТ и С-реактивного белка относительно указанных выше пороговых значений [13]. Российские специалисты также обращают внимание на то, что особенностью КГЛ является не только снижение количества тромбоцитов, но и нарушение их функциональной и секреторной активности, адгезии и агрегации [8, 21].

Статистически значимыми лабораторными прогностическими факторами летального исхода являются: число тромбоцитов ниже 20•109/л; АЛТ > 900 МЕ/л; АСТ > 700 МЕ/л; АЧТВ > 60 с; фибриноген < 1,1 г/л [9]. Российские специалисты предлагают несколько иной набор прогностических факторов и их пороговых значений: число тромбоцитов ниже 55х109/л; АЛТ выше «двух границ нормы», АЧТВ > 113 с; протромбиновый индекс < 67% [22]. Для прогноза исхода КГЛ можно также пользоваться международной шкалой тяжести ДВС-синдрома [23]. Оценка по шкале выше 4 баллов соответствует тяжелому течению заболевания, оценка выше 6 типична для умерших больных [24]. Развитие декомпенсированного, с внутренними кровотечениями, ДВС-синдрома, как правило, приводит к полиорганной недостаточности и смерти на 3–10-й день от начала заболевания.

Летальность КГЛ в XX веке, по различным сообщениям, варьировала от 10 до 50%, в частности в СССР она достигала 20% [14]. По данным, полученным в России, Турции и Иране в XXI веке, летальность при клинически выраженных, лабораторно подтвержденных формах инфекции не превышает 5–10% [1, 9, 12, 13, 25]. Это может быть обусловлено как повышением качества диагностики и активным выявлением среднетяжелых и легких форм КГЛ, особенно без геморрагического синдрома, так и, в известной мере, объективными причинами (своевременным и адекватным оказанием медицинской помощи).

Завышенная оценка биологической опасности вируса ККГЛ выразилась в отнесении его в США и Европе к микроорганизмам 4-й (высшей) степени патогенности, что негативно сказывается на экспериментальных исследованиях данной инфекции (в ряде работ на культурах клеток и животных в качестве суррогата вируса ККГЛ используют «менее патогенный» найровирус Хазара или артеривирус геморрагической лихорадки обезьян [26, 27]. В этих странах формальная необходимость госпитализации больных КГЛ исключительно в условиях наивысшей биобезопасности отсрочивает начало лечения и затрудняет его в целом [3, 28].

Лабораторная диагностика КГЛ

Возможности дифференциальной клинической диагностики КГЛ ограничены, поскольку множество вирусных и бактериальных инфекций, включая трансмиссивные, протекает с развитием геморрагического синдрома и/или ДВС. Встречаются и диагностические ошибки, при которых у больных КГЛ диагностируют соматические заболевания, сопровождающиеся кровоточивостью. Для исключения этих ошибок важен учет эпидемиологического анамнеза. Практический опыт оказания медицинской помощи в Ставропольском крае в 2000–2005 гг. показал, что при первичном обращении ошибочный диагноз был поставлен 75% больных КГЛ, а при поступлении в стационар – почти 50%. При этом ошибочный диагноз на амбулаторном или госпитальном этапе был существенным фактором риска летального исхода при КГЛ (соотношение шансов больше 3) [22]. Поэтому умение выявить по клинико-эпидемиологическим показателям больных с подозрением на КГЛ с целью своевременного применения эффективных методов лабораторной диагностики КГЛ невозможно переоценить. В современной практике чаще всего применяются 3 метода диагностики КГЛ, обладающие своими преимуществами и ограничениями [29].

Вирусологический метод – изоляция вируса ККГЛ из биологического материала путем заражения новорожденных мышей или культур клеток – является «золотым стандартом» диагностики. Заражение новорожденных мышей – более чувствительный вариант методики, вирус может быть изолирован вплоть до 12-го дня заболевания. Однако работу с живой культурой ККГЛ можно производить только на базе лабораторий, имеющих разрешение и возможность работы с микроорганизмами 2-й группы патогенности (по российской классификации), а сам процесс изоляции занимает несколько дней. Следует отметить также, что вирусологический метод, требующий присутствия живого возбудителя в образце, обладает меньшей диагностической чувствительностью, чем метод ПЦР (см. ниже). В работе [30] из 41 образца сыворотки крови больных КГЛ, положительных в ПЦР, лишь 26 (63%) проб оказались способными заразить новорожденных мышей и/или культуру клеток Vero. Поэтому вирусологический метод применяют в основном в исследовательских целях, для последующего детального изучения штаммов вируса ККГЛ.

Для практической диагностики наиболее широко используют выявление специфических IgM- и/или IgG-антител в сыворотке крови больного методом ИФА [29]. Иммунодоминантным антигеном вируса ККГЛ является нуклеокапсид; несмотря на различие генотипов, штаммы вируса ККГЛ относятся к одному серотипу [3, 14]. Антитела к вирусу ККГЛ, по-видимому, не обладают кросс-реактивностью по отношению к другим патогенным микроорганизмам, циркулирующим в России (при исследовании больных из других регионов следует учитывать возможность кросс-реактивности с найровирусами Дугбе, Хазара и др.). Это является существенным преимуществом, позволяющим использовать одну тест-систему для диагностики инфекции, вызванной разными генотипами вируса ККГЛ. ИФА-тест нового поколения использует в качестве антигена рекомбинантный нуклеопротеин ККГЛ, что позволяет избежать использования поликлональных антител и стандартизовать методику [31].

В России тест-системы для выявления IgM и IgG к вирусу ККГЛ выпускают ЗАО «Биосервис» (http://bioservice.com.ru) и ЗАО „ВЕКТОР-БЕСТ” (www.vector-best.ru). Принципиальным ограничением ИФА-диагностики КГЛ является то, что IgM-антитела появляются в среднем на 5–7-й день заболевания/госпитализации, а IgG-антитела – не ранее 2–3-й недели болезни. Таким образом, лабораторная диагностика в момент поступления больного затруднена, что создает проблемы для выбора адекватной терапии, своевременного проведения противоэпидемических мероприятий, предотвращения внутрибольничного инфицирования [12, 32]. У большинства умерших от КГЛ больных содержание IgM- и, тем более, IgG-антител в крови не достигает диагностического уровня [3, 9, 33]. IgM-антитела сохраняются в крови переболевших КГЛ в течение полугода, IgG-антитела – по меньшей мере 5 лет [31, 34].

К настоящему моменту предложен ряд методик детекции РНК вируса ККГЛ и диагностики КГЛ с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), предусматривающие различные способы выявления ПЦР-продукта: электрофорез в агарозном геле [35, 36], гибридизацию с зондами на микрочипах [37], ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РРВ) со специфическими зондами [38–42]. Предел детекции РНК вируса ККГЛ в ПЦР достигает 100 копий генома/ мл образца (например, плазмы крови) или около 5–10 копий генома в реакцию [38]. Показано, что в экспериментальных условиях одна копия генома вируса ККГЛ соответствует приблизительно одной инфекционной «фокус-формирующей единице» [43]. Проблемой при разработке ПЦР-диагностики КГЛ является существенное разнообразие нуклеотидных последовательностей вируса ККГЛ, которое к тому же для ряда генотипов вируса ККГЛ описано недостаточно. Известны варианты ПЦР-методик, использующих в качестве мишени сегмент M [43] или сегмент L (АмплиСенс® CCHFV-FL), но большинство методик используют в качестве мишени сегмент S, охарактеризованный наиболее полно [35-40, 42]. Некоторые методики специализированы для выявления только одного генотипа, циркулирующего на определенной территории [39], другие нацелены на то, чтобы выявлять несколько генотипов или все известные генотипы [35, 38, 41]. При этом методики на основе микрочипов способны работать и в случае появления отдельных ранее не описанных мутаций [37].

Как и при многих инфекциях, плазма является лучшим материалом для ПЦР-диагностики по сравнению с сывороткой крови. РНК вируса ККГЛ выявляется также в слюне и моче больных в количестве, сопоставимом с плазмой, что можно использовать для неивазивной ПЦР-диагностики КГЛ [44]. Следует отметить, что в работе [44] не изучалась жизнеспособность вируса ККГЛ, а в исследованиях 1967–1969 гг. А.М. Бутенко и М.П. Чумакову не удалось выделить вирус из мочи 10 больных КГЛ в разгар болезни с выраженной виремией [45].

Принципиальным преимуществом ПЦР-диагностики КГЛ является то, что вирусная нагрузка в крови больного, как правило, максимальна при госпитализации, сохраняется у большинства больных на 7–14-й день заболевания, а у некоторых больных выявляется даже на 3-й неделе болезни. Таким образом, диагностика возможна в ходе всего лечения, а в критический момент поступления специфичность и чувствительность ПЦР-диагностики превышает 95% [33]. По имеющимся сведениям, Россия является единственной страной, в которой ПЦР-тест-системы для диагностики КГЛ официально сертифицированы (имеют регистрационные удостоверения РФ № ФСР 2008/03360 от 15.10.08 и № ФСР 2012/12997 от 03.02.12), промышленно выпускаются и широко используются в практике [32]. Тест-системы «АмплиСенсR ККГЛ-EPh» с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле и «АмплиСенсR CCHFV-FL» с флуоресцентной детекцией разработаны в Центральном НИИ эпидемиологии и распространяются через ООО «ИнтерЛабСервис» (www.interlabservice.ru).

В сертификационных испытаниях тест-системы «АмплиСенсR ККГЛ-EPh» были установлены ее 100% специфичность и чувствительность при работе со штаммами вируса ККГЛ различных генотипов и штаммами гетерологичных вирусов. При сопоставлении аналитической чувствительности вирусологического метода заражения новорожденных белых мышей и тест-системы «АмплиСенс® ККГЛ-EPh» было показано, что инфекционная активность вируса на мышах составила 107 ЛД50/мл, а чувствительность ПЦР-тест-системы при разведении вируса плазмой крови была на порядок лучше, то есть позволяла выявлять концентрации вируса ККГЛ, равные 0,1 ЛД50/мл и ниже. Одновременно было показано, что аналитическая чувствительность (предел детекции) тест-системы «АмплиСенсR ККГЛ-EPh» составляет 5х103 копий генома/мл сыворотки или плазмы крови. При исследовании клинических образцов сыворотки крови от 21 больного с верифицированным диагнозом КГЛ и 100 контрольных образцов сыворотки была показана 100% специфичность ПЦР-тест-системы и ее 100% чувствительность при использовании образцов, взятых в 1-ю неделю заболевания [36].

Получен также патент на изобретение № 2276362 «Способ выявления вируса КГЛ в биологическом и полевом материале», позволяющий производить предварительную селективную концентрацию вируса на поверхности магнитных иммунных сорбентов и тем самым улучшать предел его детекции методом ПЦР. Использование метода концентрации и очистки от примесей, ингибирующих ПЦР, особенно эффективно при исследовании клещей [46].

Лабораторная методика диагностики КГЛ, аналогичная ПЦР-тест-системе «АмплиСенсR ККГЛ-EPh», использовалась в Ставропольском крае, Волгоградской и Ростовской областях уже в 2001–2002 гг. [34, 35, 47, 48]. Результаты нашего исследования 366 сывороток крови, собранных от 178 больных с подозрением на КГЛ в Ставропольском крае в 2001 г. (66 больных) и в 2002 г. (112 больных), позволили оценить диагностические возможности лабораторных методик в реальных условиях. У 5 больных ПЦР-положительные пробы были взяты в 1-ю неделю заболевания, но отсутствовали более поздние парные сыворотки для серологического подтверждения методом ИФА. У 18 больных, напротив, диагноз КГЛ был поставлен на основе выявления диагностического титра специфических IgM и/или сероконверсии по IgG, но не было необходимых для ПЦР-диагностики проб, взятых в 1-ю неделю заболевания. Результаты, полученные при обследовании этих 23 больных, не использовали при сопоставлении ПЦР и ИФА-методик. У 88 больных не выявлены ни РНК вируса ККГЛ, ни специфические антитела к вирусу ККГЛ (истинно-отрицательные результаты), и, таким образом, диагноз КГЛ был снят. У 62 больных диагноз КГЛ был подтвержден как методом ПЦР, так и методом ИФА (истинно-положительные результаты). У 2 больных в крови обнаружена РНК вируса ККГЛ, но выработка специфических антител на 9–13-й день болезни не обнаружена. Мы трактуем это как истинно-положительные результаты ПЦР и ложно-отрицательные результаты ИФА. У 3 больных отмечено 4-кратное нарастание титра специфических IgG, но пробы, взятые в 1-ю неделю болезни, были ПЦР-отрицательны, что предположительно являлось ложно-отрицательным результатом ПЦР. Таким образом, по самым строгим оценкам, специфичность метода ПЦР относительно метода ИФА составила не менее 98%, а чувствительность – 95%.

Результаты диагностики на разных этапах развития инфекции у больных с подтвержденным диагнозом КГЛ могут быть суммированы следующим образом (см. рисунок). В первые 4 дня болезни чувствительность ПЦР-диагностики превышает 95%, а серологическая диагностика практически невозможна. К концу 1-й недели специфические IgM-антитела выявляются приблизительно у 50% больных КГЛ, специфические IgG-антитела – только у 10–15% больных. На 2-й неделе заболевания процент положительных ПЦР-находок снижался, на 3-й не превышал 10–20%, к 4-й неделе вирус элиминировался из крови всех больных КГЛ. Одновременно возрастает доля проб, содержащих IgM и IgG в диагностических титрах. Максимум (92%) IgM-положительных проб достигается на 3-й неделе заболевания, к 4-й неделе специфические IgG выявляются у 100% больных КГЛ. Результаты четко показывают место двух лабораторных методов, которые должны применяться для диагностики КГЛ в совокупности. Серологический метод пригоден для постановки окончательного диагноза перед выпиской больного, то есть имеет в основном ретроспективное эпидемиологическое значение. Метод ПЦР, напротив, незаменим в первые дни болезни, что чрезвычайно важно для выбора адекватной терапии, предотвращения случаев внутрибольничного инфицирования, проведения противоэпидемических мероприятий в очаге.

Рисунок.

Практическое применение коммерческой тест-системы «АмплиСенс® ККГЛ-EPh» и тест-систем для выявления антител к вирусу ККГЛ ЗАО «Биосервис» в 2006–2009 гг. в Астраханской области для исследования сывороток крови, взятых у 33 больных с подтвержденным диагнозом КГЛ [32], показало, что специфичность ОТ-ПЦР равна 100%, а чувствительность – 95% на 4–8-й день болезни и 38% на 9–12-й день. Позже РНК вируса ККГЛ не выявлялась. Диагностика по наличию IgM была возможна, начиная с 9-го дня болезни (чувствительность – 92%), а по IgG – только после 12-го дня (чувствительность – 100%).

Для количественного исследования РНК вируса ККГЛ в сыворотке крови был разработан и использован вариант ПЦР-методики с детекцией в режиме реального времени с интеркалирующим красителем SYBR GREEN. В данном формате исследования использовали неконкурентный внутренний контрольный образец (генно-инженерный конструкт генома вируса гепатита С – ВКО HCV) с известной концентрацией. Предварительно была определена концентрация кДНК контролей-калибраторов для вируса ККГЛ (К1 CCHFV, K2 CCHFV) и кДНК HCV (K1 HCV и K2 HCV), по которым на приборе iQiCycler («Biorad», США) построена калибровочная кривая, определяющая линейный диапазон измерений. Экстракцию РНК проводили в присутствии ВКО HCV, ПЦР-реакцию с детекцией в реальном времени – в присутствии К1- и К2-калибраторов для ССHFV и HCV. Путем пересчета с использованием калибровочной кривой определяли вирусную нагрузку – число копий генома вируса ККГЛ в образце. Данный подход был использован для оценки величины и скорости изменения вирусной нагрузки в процессе заболевания и лечения КГЛ, для изучения патогенеза инфекции, а также для коррекции и оценки эффективности терапии [8, 47, 49].

В XXI веке на фоне осложнения эпидемической обстановки по КГЛ произошло несколько важных изменений в общем понимании этой инфекции. Существенно улучшились выявление и диагностика случаев КГЛ со среднетяжелым и легким течением без геморрагического синдрома. В результате возрос вклад этих клинических форм в заболеваемость КГЛ в целом. На основе большого массива наблюдений описан спектр симптомов КГЛ, определена частота их встречаемости. Изучен комплекс клинических и лабораторных показателей, которые применяются или могут применяться для прогноза течения и исхода КГЛ; их относительная значимость как прогностических факторов оценена с помощью статистических методов. Разработан и сертифицирован ряд диагностических препаратов нового поколения [50], которые пришли на смену диагностическим методам, применявшимся в прошлом веке.