Установление природы поражения ЦНС у больных ВИЧ-инфекцией по-прежнему является сложной задачей. В реальной клинической практике у значительного количества пациентов диагноз формулируется как «энцефалит неясной этиологии» [1]. Манифестная цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), нередко протекающая с поражением головного и спинного мозга – одно из наиболее частых и тяжелых вторичных заболеваний у больных ВИЧ-инфекций [2]. У ВИЧ-инфицированных лиц с глубокой иммуносупрессией ЦМВ-энцефалит – ведущая причина выраженных нейрокогнитивных расстройств, достигающих степени деменции [3].

Клиническая расшифровка этиологии неврологической патологии вызывает большие трудности. Дифференциальная диагностика между ВИЧ-энцефалитом, прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатией и ЦМВ-энцефалитом – состояниями, протекающими с интеллектуально-мнестическим синдромом, без проведения исследований спинномозговой жидкости (СМЖ) и крови на наличие ДНК возбудителей нейроинфекций и РНК ВИЧ, крайне затруднителен [4]. Вместе с тем, клиническое значение качественного и количественного содержания ДНК ЦМВ в СМЖ, лейкоцитах крови и плазме крови для подтверждения ЦМВ-природы энцефалита у больных ВИЧ-инфекцией остается не установленным.

Цель исследования – определение диагностических чувствительности и специфичности концентраций ДНК ЦМВ в СМЖ, лейкоцитах крови и плазме крови для верификации энцефалита ЦМВ-этиологии у больных ВИЧ-инфекцией.

Материалы и методы

Проведено клиническое наблюдение и анализ историй болезни 5485 больных ВИЧ-инфекцией (3333 – на стадиях 4Б (СПИД), 4В (СПИД)), находившихся на лечении в Инфекционной клинической больнице № 2 (ИКБ № 2) Департамента здравоохранения города Москвы, за четырехлетний период. Медиана (Ме) возраста пациентов составила 33 года (19–72 года). Мужчин было 3998 (72,9%), женщин – 1487 (27,1%). АРТ получали лишь 17% пациентов. Умерли 593 (10,8%) чел. Поражение ЦНС было диагностировано у 1310 госпитализированных больных ВИЧ-инфекцией, из них умерли 372. Секционные исследования осуществляли в патологоанатомическом отделении ИКБ № 2.

Проводили МР-томографию головного мозга c контрастированием, диагностическую люмбальную пункцию с микроскопическим и биохимическим анализами СМЖ. С целью этиологической расшифровки поражений ЦНС исследовано 1667 образцов СМЖ методом ПЦР-РВ (ОТ-ПЦР-РВ) с качественным или количественным определением РНК ВИЧ, ДНК ЦМВ, ВЭБ, ВГЧ-6 А/В, ВПГ-1,-2, ВВЗ, B.secuhominis, грибов рода Candida, T. gondii, C. neoformans, а также 743 образца сыворотки крови и 3623 образца плазмы крови с количественным определением ДНК ЦМВ. Молекулярно-биологические исследования проводили с использованием наборов реагентов производства ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Критериями постановки диагноза ЦМВ-энцефалита (энцефаловентрикулита), помимо данных молекулярно-биологических методов, служили: патоморфологическое подтверждение ЦМВ-поражения головного мозга и/или комплекс относительно характерной клинической картины болезни (быстро прогрессирующие нейрокогнитивные нарушения вплоть до развития деменции у большинства больных, скудные и поздно проявляющиеся неврологические симптомы в форме горизонтального нистагма, в ряде случаев – пареза глазодвигательного нерва и невропатии лицевого нерва, головокружения, непостоянных головных болей без повышенной судорожной активности в сочетании с лихорадкой ремиттирующего типа, быстрым существенным снижением веса, выраженной слабостью, анорексией, наличием у части больных ретинита), данные МРТ головного мозга (расширение желудочков головного мозга, утолщение их стенок, наличие мелких очагов в перивентрикулярных областях), данные анализа СМЖ (существенное повышение содержания белка при отсутствии плеоцитоза или мононуклеарном плеоцитозе, нормальное содержание глюкозы), отсутствие или незначительное количество ДНК других возбудителей нейроинфекций и РНК ВИЧ в образцах СМЖ, неэффективность лечения бисептолом возможного церебрального токсоплазмоза.

Для статистической обработки результатов использовали пакеты статистических программ Statistica v. 10.0 и SPSS v. 20, а также язык программирования R. Проверку исследуемых признаков на нормальность проводили с помощью критерия Колмогорова–Смирнова в связи с большим объемом выборки. При отсутствии нормальной распределенности признака вычисляли Ме, интерквартильный размах (25–75 процентили), а также приводили минимальное и максимальное значения. Для проверки гипотезы об однородности распределений признака в двух независимых группах использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Распределение пациентов на группы в зависимости от количества копий ДНК ЦМВ в плазме крови и СМЖ проводили в соответствии с установленными пороговыми значениями: 0, 1000, 10 000, 100 000 копий. Таким образом, непрерывные переменные, соответствующие исходным показателям, были преобразованы в дискретные, где каждому значению новой переменной соответствовал определенный интервал значений исходной непрерывной переменной. После этого проведено исследование взаимосвязей между признаками с помощью анализа таблиц сопряженности с применением критерия χ2 Пирсона. У значительной части больных ДНК ЦМВ в пробах не была обнаружена, в этом случае признаку присваивали значение «0». Интерес представляли не только наличие статистически значимых связей между сгруппированными показателями, но и особенности распределения пациентов по ячейкам таблиц сопряженности. Количество измерений каждого лабораторного маркера было различным в связи с ретроспективным характером исследования и тем, что назначения исследований определялись клинической ситуацией и состоянием больного. Поэтому при описании результатов применения статистических критериев дополнительно указывали объем выборки, на которой результат был получен. Поиск ассоциаций концентрации ДНК ЦМВ в биоматериалах и наличия ЦМВ-энцефалита проводили с применением ROC-анализа. Для каждого из биоматериалов были найдены отрезные точки концентраций ДНК ЦМВ, для которых значения чувствительности и специфичности совпадали. Проанализировано изменение чувствительности и специфичности в зависимости от концентрации ДНК ЦМВ в биоматериале, что позволило выявить ряд дополнительных клинически значимых отрезных точек. Уровень значимости для проверяемых статистических гипотез принимали равным 0,05.

Результаты

Поражение ЦНС было диагностировано у 23,8% госпитализированных больных ВИЧ-инфекцией, 39,3% из числа пациентов на стадиях вторичных заболеваний, 4Б (СПИД) 4В (СПИД). Умерли 28,4% из числа больных с поражением ЦНС. 62,7% умерших больных имели поражение головного мозга той или иной природы. Спектр и частота заболеваний, протекающих с поражением ЦНС, у стационарных пациентов с ВИЧ-инфекцией, а также частота выявления ДНК возбудителей нейроинфекций и РНК ВИЧ в СМЖ описаны нами ранее [5].

Манифестная ЦМВИ имела место у 448 (13,4%) больных на стадии СПИДа. ЦМВ-энцефалит диагностирован у 28 больных ВИЧ-инфекцией: 0,5% среди госпитализированных лиц на разных стадиях ВИЧ-инфекции, 0,8% среди больных ВИЧ-инфекцией на стадии СПИДа. ЦМВ-энцефалит был причиной тяжелой неврологической патологии у 2,1% из 1310 больных с поражением ЦНС, 4,8% из 584 пациентов с установленной этиологией поражения ЦНС, 6,3% среди лиц с клинически выраженной ЦМВИ.

Из 743 исследуемых образцов крови ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови была обнаружена в 393 (52,8%) случаях. ЦМВ-энцефалит имел место лишь у 5 (1,3%) пациентов с наличием ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови и ни у одного из 738 больных при отсутствии вируса (табл. 1).

Содержание ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови составило от 0,5 до 5,6 lg копий/105 клеток (Ме – 1,8, интерквартильный размах [1,2–2,5] lg копий/105 клеток). Из 743 пациентов ДНК вируса в лейкоцитах крови отсутствовала у 350 (47,2%), была выявлена в концентрации < 1,0 lg копий/105 клеток у 19 (2,6%), 1,0–2,0 lg копий/105 клеток – у 212 (28,5%), 2,1–2,9 lg копий/105 клеток – у 94 (12,6%), ≥ 3,0 lg копий/105 клеток – у 68 (9,2%). Наличие ЦМВ-энцефалита у больного характеризовалось более высокой концентрацией ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови (критерий Манна–Уитни; p < 0,0001).

Для определения диагностического значения количественного содержания ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови при ЦМВ-поражении головного мозга был использован ROC-анализ, в ходе которого выделяли отрезные точки количества копий ДНК вируса и определяли их чувствительность и специфичность (табл. 2). Для отрезного значения количества ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови, равного 4,95 lg копий/105 клеток, специфичность составила 99,2% при чувствительности 20%, для значения 4,65 lg копий/105 клеток – 98,5 и 40% соответственно. Для низкой отрезной точки количества ДНК ЦМВ, равной 1,85 lg копий/105 клеток, чувствительность составила 100% при специфичности 55,7%.

Из 3623 образцов плазмы крови ДНК ЦМВ обнаружена в 623 (17,2%) случаях. ЦМВ-энцефалит диагностирован у 28 (2,9%) из 623 пациентов с наличием ДНК ЦМВ в плазме крови и у 3 (0,2%) больных при отсутствии вируса в плазме крови (1522 образцов) (см. табл. 1).

Концентрация ДНК ЦМВ в плазме находилась в пределах от 100 до 10 000 000 копий/мл (Ме – 910, интерквартильный размах [165–4350] копий/мл). Из 3623 пациентов ДНК вируса в плазме крови отсутствовала у 3000 (82,8%), была выявлена в концентрации < 1000 копий/мл у 322 (8,9%), 1000–10 000 копий/мл – у 202 (5,6%), 10 000–100 000 копий/мл – у 82 (2,2%), > 100 000 копий/мл – у 27 (0,5%) случаев. Наличие ЦМВ-энцефалита у больного характеризовалось более высокой концентрацией ДНК ЦМВ в плазме крови (критерий Манна–Уитни; p < 0,0001).

Применение ROC-анализа концентраций ДНК ЦМВ в плазме крови для установления диагностических чувствительности и специфичности при ЦМВ-энцефалите позволило выделить: отрезное значение концентрации ДНК ЦМВ, равное 352 170 копий/мл, специфичность которого составила 99%, чувствительность 5,6%; отрезное значение концентрации ДНК ЦМВ, равное 62 700 копий/мл, со специфичностью 95,9% и чувствительностью 16,7%. Для отрезной точки концентрации ДНК ЦМВ в плазме, равной 520 копий/ мл, чувствительность составила 100% при специфичности 42,6%, а для отрезной точки, равной 1250 копий/мл, – 94,4 и 56,5% соответственно.

При исследовании 1667 образцов СМЖ больных с патологией ЦНС ДНК ЦМВ была выявлена в 145 (8,7%) случаях. ЦМВ-энцефалит имел место у 25 (17,2%) из 145 пациентов с наличием ДНК ЦМВ в СМЖ и лишь у 3 (0,2%) их 1522 больных при отсутствии вируса. Диагностическая чувствительность выявления ДНК ЦМВ в СМЖ у больных ВИЧ-инфекцией с поражением ЦНС составила 99,8%. Соответственно отсутствие ДНК ЦМВ в СМЖ почти со 100% вероятностью исключает наличие ЦМВ-энцефалита у таких больных. Диагностическая специфичность обнаружения в СМЖ ДНК ЦМВ составила лишь 17,2%. Соответственно, факт присутствия ДНК ЦМВ в СМЖ не подтверждает ЦМВ-природу поражения ЦНС.

Низкая диагностическая специфичность качественного определения ДНК ЦМВ в СМЖ свидетельствует о необходимости количественного определения ДНК вируса для верификации диагноза ЦМВ-энцефалита и обоснования назначения специфической противовирусной терапии. Содержание ДНК ЦМВ в СМЖ составило от 47 до 4 373 385 копий/мл (в 8,7% случаев (Ме – 400, интерквартильный размах [200–1440] копий/мл).

Из 1667 пациентов ДНК вируса в СМЖ отсутствовала у 1522 (91,3%) больных, была выявлена в концентрации < 1000 копий/мл у 100 (6%), 1001–10 000 копий/ мл – у 27 (1,6%), 10 001–100 000 копий/мл – у 13 (0,8%), > 100 000 копий/мл – у 5 (0,3%). Наличие ЦМВ-энцефалита у больного характеризовалось более высокой концентрацией ДНК ЦМВ в плазме крови (критерий Манна–Уитни; p < 0,0001) (табл. 3).

Для определения диагностического значения количественного содержания ДНК ЦМВ в СМЖ при ЦМВ-поражении головного мозга был использован ROC-анализ, в ходе которого выделяли отрезные точки количества копий ДНК вируса в СМЖ и определяли их чувствительность и специфичность. Для отрезного значения количества ДНК ЦМВ в образцах СМЖ, равного 28 500 копий/мл, специфичность составила 100% при чувствительности 50%; для количества ДНК ЦМВ, равного 16 600 копий/мл, 98,8 и 75% соответственно. Для низкой отрезной точки, равной 70 копий/ мл, чувствительность составила 100% при специфичности 1,2%, для значения количества ДНК ЦМВ 150 копий/ мл – 93,8 и 9,6%, соответственно.

Обсуждение

У больных ВИЧ-инфекцией манифестная ЦМВИ – одно из наиболее частых вторичных заболеваний (13,4% случаев среди госпитализированных больных на стадии СПИДа), в 6,3% случаев протекающее с поражением головного мозга в виде энцефалита или энцефаловентрикулита, диагностика которого крайне затруднена, о чем свидетельствует ряд последних публикаций [1, 4].

Учитывая высокую чувствительность используемого в исследовании молекулярно-биологического метода, отсутствие ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови, плазме крови, СМЖ исключает ЦМВ-природу поражения головного мозга у больных ВИЧ-инфекцией, но в связи с низкой специфичностью качественного обнаружения ДНК ЦМВ в указанных биологических средах, факт присутствия ДНК вируса в лейкоцитах и плазме крови, а также в СМЖ не подтверждает наличия ЦМВ-энцефалита. Тем не менее, в практическом здравоохранении используют именно качественный анализ при определении ДНК ЦМВ в СМЖ и других биологических материалах, что не позволяет своевременно и точно диагностировать ЦМВ-поражение ЦНС, а публикации о диагностическом значении различных концентраций ДНК ЦМВ в СМЖ отсутствуют.

Концентрация ДНК ЦМВ в лейкоцитах и плазме крови, СМЖ имеет широкие пределы от десятков до нескольких миллионов копий в образце. В результате применения ROC-анализа были получены отрезные точки по концентрации ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови, плазме крови и СМЖ, позволяющие с высокой долей достоверности подтвердить или исключить наличие ЦМВ-энцефалита у больного ВИЧ-инфекцией. При проведении исследований для лейкоцитов крови и плазмы крови были найдены пороговые значения, обладающие 100% чувствительностью при относительно высокой специфичности, в то время как для СМЖ были найдены точки, обладающие 100% специфичностью при относительно высокой чувствительности. Таким образом, для проверки отсутствия ЦМВ-энцефалита лучше использовать исследование крови (лейкоциты или плазму), а для проверки наличия этого заболевания целесообразно проводить анализ на количественное содержание ДНК ЦМВ в СМЖ. При лабораторной верификации энцефалита ЦМВ-этиологии оптимальным является исследование методом ПЦР двух видов биологического материала: СМЖ и лейкоцитов или плазмы крови. При этом следует учитывать тот факт, что СМЖ является основным биологическим материалом для исследования, а лейкоциты и плазма крови – дополнительными.

Наличие энцефалита ЦМВ-этиологии характеризуется более высокой концентрацией ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови, плазме крови и СМЖ. Диагностическим значением обладает определенная концентрация ДНК вируса в биологических средах пациента. Выявление ДНК ЦМВ в СМЖ в концентрации ≥ 16 600 копий/ мл, лейкоцитах крови – 4,65 lg копий/105 клеток, плазме крови – 62 700 копий/мл, с 95% вероятностью подтверждает ЦМВ-природу поражения головного мозга, служит основанием для постановки диагноза ЦМВ-энцефалита и проведения курса этиотропной терапии. Отсутствие ДНК ЦМВ или выявление ДНК вируса в лейкоцитах крови в концентрации < 1,85 lg копий/105 клеток, плазме крови – < 1250 копий/мл, СМЖ – < 150 копий/мл с 90% вероятностью исключает наличие ЦМВ-энцефалита и требует продолжения диагностического поиска для установления природы патологии ЦНС.

Заключение

Количественное определение ДНК ЦМВ при исследовании образцов СМЖ и крови методом ПЦР на имеет важного диагностического значения для верификации энцефалита ЦМВ-этиологии у больных ВИЧ-инфекцией.