Оптимизация диаг­ностической подсистемы эпидемиологического надзора за бактериальными острыми кишечными инфекциями


Шайхиева Г.М., Ефимов Г.Е., Мавзютов А.Р., Кулуев Б.Р., Кайданек Т.В.

1Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России, Уфа; 2Уфимский научный центр РАН
Цель исследования. Выявление особенностей эпидемиологических проявлений бактериальных острых кишечных инфекций (БОКИ) с обоснованием групп обследуемых больных для оценки эффективности микробиологического и молекулярно-генетического методов их лабораторной диагностики.
Материалы и методы. Оценка информативности и эффективности полимеразной цепной реакции (ПЦР) и микробиологического метода диагностики БОКИ проведена на наиболее эпидемиологически значимой по заболеваемости этими инфекциями группе детей.
Результаты. В эпидемиологически значимой по БОКИ группе детей в возрасте 0–6 лет получена более высокая в сравнении с микробиологическим методом валидность ПЦР, выявившая также существенную роль в развитии БОКИ условно-патогенной флоры, более чем в половине случаев представленной сочетаниями различных их видов.
Заключение. Для оптимизации диагностической подсистемы эпидемиологического надзора за БОКИ необходимо широкое внедрение в лабораторную диагностику метода ПЦР.

Эффективность существующих систем эпидемиологического надзора за любой патологией, в том числе за бактериальными острыми кишечными инфекциями (БОКИ), в значительной степени зависит от валидности используемых методов лабораторной диагностики. Среди них основным в случаях БОКИ является микробиологический метод, который при удовлетворительной специфичности изначально характеризуется низкой чувствительностью и диагностической эффективностью, а также длительностью проведения при значительной ресурсоемкости [1, 2]. Более того, ситуация усугубляется на фоне интенсивного распространения возбудителей БОКИ, устойчивых к применяемым антибактериальным препаратам, изменения этиологической роли отдельных их представителей, появления новых, трудно диагностируемых рутинными методами этиологических агентов в условиях истинного и диагностического увеличения частоты микст-инфекций, нередко обусловленных ассоциациями не только патогенных агентов (бактериально-бактериальных, бактериально-вирусных и т. д.), но и сочетаниями условно-патогенных бактерий как между собой, так и с патогенами бактериальной и вирусной природы [3–8]. Указанное сопровождается сохранением высокой доли невыясненных случаев диарей не только бактериальной, но и вирусной природы, суммарная частота которых в России колеблется от 50 до 80% [9–11]. Это во многом препятствует своевременному проведению адекватных противоэпидемических мероприятий в отношении условий и факторов, способствующих распространению всей группы острых кишечных инфекций (ОКИ), результативность которых определяется быстротой и качеством используемых лабораторных методов [12]. Из их числа наиболее перспективным способом диагностики диарей является применение ПЦР, обладающей существенно более высокой, чем микробиологический метод, чувствительностью, специфичностью и диагностической эффективностью, позволяющей осуществлять детекцию множества патогенов в одной пробе клинического материала в течение короткого времени [13–15]. На сегодня наиболее интенсивно метод ПЦР используется при диагностике вирусных диарей, что привело к существенному увеличению их доли в структуре ОКИ [16]. При ОКИ, вызванных патогенными бактериями, использование молекулярно-генетического и микробиологического методов суммарно выявляет наличие патогенного бактериального возбудителя в монокультуре и микст-инфекции с другими бактериальными или вирусными агентами почти у половины заболевших (49,4%), причем с применением только метода ПЦР – в 29,8% случаев и бактериологического метода – в 20,8% [17]. В меньшей степени ПЦР используется при диагностике БОКИ, обусловленных условно-патогенными бактериями, при этом их доля может выявляться более чем в половине всех случаев ОКИ и в большинстве своем – при различных их сочетаниях [18–20].

В связи с изложенным целью исследования явилось выявление особенностей эпидемиологических проявлений БОКИ с обоснованием групп обследуемых больных для оценки эффективности микробиологического и молекулярно-генетического методов их лабораторной диагностики.

Материалы и методы

Изучение эпидемиологических проявлений заболеваемости БОКИ в Уфе и Республике Башкортостан (РБ) в целом проведено на основе анализа данных отчетной формы № 2 «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях» за 1997–2013 гг. Информация о численности населения исследуемых территорий за анализируемый период получена в Территориальном органе Федеральной службы государственной статистики по РБ. Полученные результаты были обработаны приемами и способами эпидемиологической диагностики [21]. Для сравнительной характеристики молекулярно-генетического и микробиологического методов лабораторной диагностики БОКИ, согласно эпидемиологическим исследованиям, из популяции больных ОКИ, госпитализированных в ГБУЗ РБ «Инфекционная клиническая больница № 4» Уфы, в соответствии с критериями исключения (вирусологическое подтверждение диагноза ОКИ на рота-, норво- и астровирусы) и включения (случаи наибольшего риска заболеваемости ОКИ, подтвержденные и неподтвержденные микробиологическим методом) была отобрана когорта пациентов из 145 детей в возрасте 0–6 лет (основная группа). Из их числа первая подгруппа, включавшая 101 больного ОКИ, была представлена детьми с идентифицированными у них бактериальными возбудителями ОКИ; она маркировалась в дальнейшем как подгруппа больных БОКИ. Другая, представленная 44 детьми и не имевшая на момент начала обследования вирусологического и бактериологического подтверждения диагноза, именовалась подгруппой больных ОКИ невыясненной этиологии (ОКИНЭ). В контрольную группу вошли 23 ребенка, сопо­ставимые по возрасту с детьми основной группы, у которых первоначальные диагнозы ОКИ в последующем клиницистами были представлены как «лакунарная ангина», «ОРЗ» и «ОРВИ».

Методом ПЦР идентификацию бактериальных патогенов ОКИ осуществляли в тех же образцах клинического материала (фекалии) больных основной (подгруппы БОКИ и ОКИНЭ) и контрольной групп, с которыми проводились микробиологические исследования. Из указанных образцов клинического материала в условиях лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН проводили выделение тотальной ДНК, используя стандартные наборы («ДНК-сорб-АМ», Россия). Подбор праймеров, пригодных для ПЦР- идентификации условно-патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae осуществляли, используя опубликованные в GenBank последовательности нуклеотидов генов 16S рРНК: Citrobacter spp. – GU458292.1, Hafnia spp. – EU196322.1, Klebsiella spp. – GU458293.1, Proteus spp. – FJ711760.1 и Escherichia coli – AB548582.1. Для ПЦР-идентификации бактерий Salmonella Enterica, Shigella flexneri, Yersinia enterocolitica праймеры подбирались после компьютерного выравнивания геномов этих микроорганизмов с геномами других Enterobacteriaceae к фрагментам, не имеющим гомологии с другими представителями данного семейства. Для идентификации Campilobacter fetus была подобрана уникальная нуклеотидная последовательность от 657 631 до 658 422 положения в геноме данного микроорганизма (CP003871.2), содержащая ген flgG, кодирующий белок стержня базального тела жгутиков. Для Staphylococcus аureus подбор праймеров и оптимальных условий осуществления ПЦР проводили с помощью набора компьютерных программ Lasergene фирмы «DNASTAR» (США), из пакета которых программа Primer Select применялась для детекции Pseudomonas aeruginosa путем подбора пары олигонуклеотидных праймеров к гену 16S рРНК. Показатели валидности ПЦР и микробиологического методов лабораторной диагностики БОКИ у обследуемых детей 0–6 лет статистически оценивали через t-критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение

В этиологической структуре ОКИ среди населения Уфы, согласно среднемноголетним данным (1997–2013), преобладали БОКИ, доля которых составила 56,8%. Между тем, вирусная природа при исследуемой патологии выявлялась лишь в 6,3% случаев, а на долю ОКИНЭ от общего числа заболевших ОКИ при этом приходилось свыше одной трети (36,9%). Аналогичный показатель в целом по РБ составил 51,6 %, тогда как доля вирусных ОКИ и удельный вес БОКИ оказались существенно более низкими (5,3 и 43,1% соответственно), чем в Уфе.

Интенсивный показатель заболеваемости БОКИ в изучаемый период на территории Уфы (230,1 ± 4,4 %ооо) также существенно превосходил таковой по РБ в целом (139,9 ± 1,8 %ооо). Такое же соотношение по проявлению БОКИ между анализируемыми территориями обнаруживалось как среди детей (897,5 ± 22,1 и 435,8 ± 7,5%ооо соответственно), так и среди взрослых (108,0 ± 3,3 и 71,5 ± 1,5 %ооо соответственно). При этом взрослые, особенно в Уфе, по интенсивности проявления БОКИ (108,0 ± 3,3 %ооо) многократно уступали детскому населению города (897,5 ± 22,1 %ооо). Эти данные свидетельствуют о значительном вкладе в формирование показателя заболеваемости БОКИ в РБ интенсивности ее проявления, регистрируемой среди детского населения Уфы, что явилось объективным обоснованием продолжения дальнейших исследований по результатам, полученным на данной территории у детей 0–14 лет. Исследуемый показатель в этой возрастной группе в ходе многолетнего наблюдения формировался при неблагоприятной тенденции развития заболеваемости БОКИ (рис. 1).

По соотношению кривой заболеваемости и линии прямолинейного тренда в ее динамике выделялся один полный цикл, ограниченный 1997–2010 гг., с периодами снижения (1997–2004) и подъема (2005–2010) исследуемого показателя. При этом 2011–2013 гг. символизировали собой начало периода снижения нового цикла, в котором показатель заболеваемости БОКИ у детей (862,6 ± 45,3 %ооо) имел сходное значение с таковым в 1997–2004 гг. (782,2 ± 39,9 %ооо). Вместе с тем в эти периоды показатели заболеваемости БОКИ детского населения в Уфе уступали уровню, зарегистрированному в период подъема полного цикла (1218,2 ± 56,8 %ооо).

Несмотря на наблюдаемые отличия, для всех периодов характерным было более интенсивное, по сравнению с детьми 7–14 лет, вовлечение в эпидемический процесс БОКИ детей в возрасте 0–6 лет, на долю которых в последние годы приходилось почти 90% от числа всех заболевших данной патологией (рис. 2). Поэтому в исследованиях по оценке эффективности лабораторной диагностики БОКИ методом ПЦР в сравнении с микробиологическим методом основную группу обследуемых формировали из когорты больных детей 0–6 лет. При оценке микробиологического способа детекции возбудителей БОКИ в основной группе детей 0–6 лет выявляемость составила 69,7% всех случаев. Этот показатель при применении ПЦР возрос на 11,1% за счет дополнительного выявления бактериальных патогенов во второй подгруппе больных детей с первоначальным диагнозом ОКИНЭ. В целом при применении метода ПЦР у основной когорты детей доля расшифрованных случаев БОКИ (80,7%) была существенно выше, чем при использовании микробиологического метода, что свидетельствует о значимо более высокой чувствительности ПЦР (р < 0,05; табл. 1).

Данное положение, несмотря на сходство у исследуемых методов диагностики показателя специфичности (см. табл. 1), а также прогностической ценности положительного и отрицательного результатов (табл. 2), подтвердилось отношением правдоподобия (ОП).

Этот показатель, обобщающий величины чувст­вительности и специфичности исследуемых методов, выявил, что шанс получения положительного результата у больного БОКИ при использовании метода ПЦР в 1,4 раза выше, а вероятность получения отрицательного результата, напротив, в 1,6 раза ниже, чем при микробиологическом исследовании.

В составе идентифицированных бактериальных патогенов оба метода в равной степени выявили более чем 5-кратное преобладание представителей условно-патогенной флоры (рис. 3).

В то же время при микробиологической детекции все случаи БОКИ были идентифицированы как моноварианты, тогда как в исследовании методом ПЦР у больных детей как в подгруппе БОКИ, так и в подгруппе ОКИНЭ соответственно в 52,5 и 52,3% случаев были представленными ассоциациями из 2–6 условно-патогенных бактерий. Подобная закономерность, по данным ПЦР, при существенно меньшей доле ассоциантов выявлялась и в группе сравнения, включавшей детей с патологией верхних дыхательных путей (табл. 3).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что при применении ПЦР по сравнению с культуральным методом значительно увеличивается доля этиологически расшифрованных случаев БОКИ, выявленных в наиболее значимой в эпидемиологическом отношении группе детей 0–6 лет, что согласуется с известным положением о зависимости чувствительности метода лабораторной диагностики от интенсивности распространенности патологии среди населения [22]. Вместе с тем оба лабораторных метода регистрировали более чем 5-кратное преобладание доли условно-патогенной флоры в этиологии БОКИ. При этом случаи БОКИ при микробиологической детекции их возбудителей регистрировались лишь в виде моноинфекции, что, очевидно, связано с реализацией систематической ошибки при проведении лабораторной диагностики данным методом [22]. Наряду с этим в ряде крупных исследований показано, что идентификация условно-патогенных бактерий как возбудителей этих инфекций в моновариантах на количественной основе не может служить объективным основанием для назначения адекватной терапии и проведения соответствующих противоэпидемических мероприятий, поскольку они столь же часто выявляются и в контрольной группе детей без симптомов диареи [23, 24]. Этим, а также с фактором времени, имеющим решающее значение для больного, обусловлено предложение ряда клиницистов [25, 26] о начале лечения пациентов с ОКИ на симптоматической и патогенетической основах, без выделения этиологических патогенов. Однако подобный подход даже при несовершенстве микробиологического метода диагностики ОКИ совершенно не приемлем в эпидемиологической практике, в которой ПЦР, особенно в мультиплексном варианте, может составить ему альтернативу.

В отличие от микробиологического метода, обнаруживавшего возбудителей БОКИ лишь в моновариантах, ПЦР более чем в половине случаев как в подгруппе БОКИ, так и подгруппе ОКИНЭ обнаруживала микст-ассоциации из 2–6 представителей условно-патогенной флоры. Однако их возможная этиологическая значимость может стать более доказательной при обнаружении взаимосвязи генетических детерминант патогенности, персистенции и антибиотикорезистентности с клиническими проявлениями болезни, наличием у них генов полиморфизма и способности образовывать биопленки, наряду с выявлением динамики нарастания уровней специфических агентов ответной реакции организма у заболевших и факторов генетической предрасположенности у них к развитию исследуемой патологии [27– 29]. Подобный подход при ОКИ, обусловленных особенно условно-патогенной флорой, может наряду с существенным улучшением эффективности их лабораторной детекции внести значительной вклад в оптимизацию не только диагностической, но и информационной составляющей системы эпидемиологического надзора за этими инфекциями. Следовательно, организационно-управленческие решения, принятые на основе таких данных, будут наиболее адекватны условиям и причинам их возникновения, и значит достаточно эффективны при проведении профилактических и противоэпидемических мероприятий по борьбе с ОКИ.


Литература


1. Дудина Н.Н., Баликин В.Ф., Акайзин Э.С., Калуцкая Т.С. Новые подходы к лабораторной диагностике острых кишечных инфекций. Вестник Ивановской медицинской академии 2007; 12(3–4): 26–36.
2. Ребриков Д.В.,Саматов Г.А. ПЦР в реальном времени. Молекулярные исследования в диагностике инфекционных заболеваний. М.: Бином, 2009; 715–855.
3. Куликов В.П., Носикова Е.В., Горбова И.В., Обухова Н.С., Басина В.В., Дунаева Н.В. Этиологическая структура острых кишечных инфекционных заболеваний в Санкт-Петербурге в 2010–2011 гг. Инфекционные болезни 2013; 11(приложение № 1): 227.
4. Ныркова О.И., Волохова О.А., Бехтерева М.К., Птичникова Н.Н., Железова Л.И., Лукьянова А.Н., Хорошева Т.С. Роль смешанной инфекции в структуре инфекционных диарей. Инфекционные болезни 2013; 11(приложение № 1): 293.
5. Сбойчаков В.Б., Захаренко С.М., Финогеев Ю.П., Крумгольц В.Ф. Эпидемиология, клиника и лабораторная диагностика бактериальных и вирусных диарей. Лечение и профилактика 2012; 3(4): 77–81.
6. Татаркина А.Н., Копейченко Т.С., Кузнецова В.М., Кирсанова Т.А., Вовк Т.Г., Кухарь Д.И., и др. Особенности моно- и микст-кишечных инфекций у детей раннего возраста. Инфекционные болезни 2011; 9 (приложение № 1): 362.
7. Тикунова Н.В., Жираковская Е.В., Тикунов А.Ю. и др. Результаты многолетних исследований патогенов, вызывающих острые кишечные инфекции у детей раннего возраста в Западной Сибири. Инфекционные болезни 2013; 11(приложение № 1): 395.
8. Kozak G., Boerlin P., Boerlin P. Janecko N., Reid-Smith R.J., Jardine C. Antimicrobial resistance in Escherichia coli isolates from swine and wild small mammals in the proximity of swine farms and in natural environments in Ontario, Canada. Appl. Environ Microbiol. 2009; 75: 559–566.
9. Миндлина А.Я. Заболеваемость кишечными инфекциями в России. Вестник РАМН 2010; 11: 30–33.
10. Онищенко Г.Г. Эпидемиологическое благополучие население России. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 2013; 1: 103.
11. Сергевнин В.И. Эпидемиология острых кишечных инфекций. Пермь: ГОУ ВПО ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава, 2008; 280 с.
12. Бровкина А.Н. Контроль возбудителей острых кишечных инфекций на основе ПЦР-РТ. Научный журнал КубГАУ 2011; 72(08): 1–9.
13. Подколзин А.Т., Мухина A.A., Шипулин Г.А. Изучение этиологии ОКИ у детей, госпитализированных в инфекционные отделения стационаров Москвы. Инфекционные болезни 2004; 4: 85–91.
14. Самборская И.Ф, Костенко И.Г., Дзюблик И.В. Преимущества мультиплексных технологий полимеразной цепной реакции в этиологической диагностике острых вирусных кишечных инфекций у детей в Украине. Инфекционные болезни 2013; 11(приложение № 1): 351.
15. Gonzales T.K., Kulow M., Park D.J., Kaspar CW, Anklam KS, Pertzborn KM, Kerrish KD, Ivanek R, Dopfer D. A high-throughput open-array qPCR gene panel to identify, virulotype, and subtype O157 and non-O157 enterohemmorrhagic Escherichia coli. Molecular and Cellular Probes 2011; 25(5–6): 222–230.
16. Марова А.А., Оксанич А.С., Каира А.Н. Применение метода мультиплексной ПЦР-РВ для дифференциальной диагностики кишечных вирусных инфекций. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 2012; 6: 39–45.
17. Вершинина М.Г., Калугина Е.Ю., Акимова О.В., Стериополо Н.А. Опыт применения молекулярно-биологического метода с детекцией продуктов с амплификации в режиме реального времени в диагностике острых кишечных инфекций. Материалы конгресса «Молекулярная диагностика». М., 2014; 1: 357–358.
18. Артемова Л.В. Диагностическая значимость ПЦР в расшифровке этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями. Автореф. дис. … канд. биол. наук. М., 2005.
19. Бакштановская И.В., Катаева Л.В., Степанова Т.Ф., Вакарина А.А., Ожирельева И.В. Эффективность применения молекулярно-биологических методов при расшифровке вспышки острой кишечной инфекции. Материалы конгресса «Молекулярная диагностика». М., 2014; 1: 363–364.
20. Кулуев Б.Р., Хайдарова Д.Я., Дубровская Д.Н., Мавзютов А.Р., Магазов Р.Ш., Ворошилова Н.Н. Опыт молекулярно-генетической диагностики острых кишечных инфекций. Медицинский вестник Башкортостана 2012; 7(1): 59–63.
21. Зуева Л.П., Еремин С.Р., Асланов Б.И. Эпидемиологическая диагностика. СПб: Фолиант, 2009. 312 с.
22. Покровский В.И., Брико Н.И., ред. Общая эпидемиология с основами доказательной медицины. Руководство к практическим занятиям. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. 494 с.
23. Бердыкулова М.М., Парманкулова Ш.Ш., Тураров Е.А., Абдиева А.М., Абуова Ж.Ж. Условно-патогенная флора в структуре острых кишечных инфекций у детей 1 года жизни. Инфекционные болезни 2013; 11(приложение № 1): 56–57.
24. Лаврёнова Э.С., Подколзин А.Т., Коновалова Т.А., Бочков И.А. Оценка роли условно-патогенной флоры в развитии острых диарейных заболеваний. Инфекционные болезни 2012; 10(3): 53–55.
25. Лобзин Ю.В., Захаренко С.М. Этиотропная терапия острых кишечных инфекций. Инфекционные болезни 2009; 7: 3662–3667.
26. Ющук Н.Д., Мартынов Ю.В., Кулагина М.Г., Бродов Л.Е. Острые кишечные инфекции. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. 402 с.
27. Григорович М.С., Зайцев Г.А. Антигены главного комплекса гистосовместимости и острые кишечные инфекции. Инфекционные болезни 2009; 7(2): 60–66.
28. Михайлова Л.И. Биология условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих кишечные инфекции. Автореф. дис. … канд. мед. наук. Волгоград, 2011.
29. Савилов Е., Анганова Е.В., Духанина А.В., Чемезова Н.Н., Зайналова А.Ю. Генетические маркеры патогенности условно-патогенных энтеробактерий и их связь с клиническими проявлениями острых кишечных инфекций у детей. Детские инфекции 2012; 3: 33–35.


Об авторах / Для корреспонденции


Для корреспонденции:
Шайхиева Гульназ Мубараковна – ст. преподаватель, соискатель каф. эпидемиологии Башкирского государственного медицинского университета Минздрава России
Адрес: 450077, Республика Башкортостан, Уфа, ул. Ленина, д. 3
Телефон: +7(347) 272-34-00
Е-mail: schaichieva@mail.ru

Сведения об авторах:
Ефимов Георгий Емельянович – д-р мед. наук, зав. каф. эпидемиологии Башкирского государственного медицинского университета Минздрава России; epidefim@mail.ru
Мавзютов Айрат Радикович – д-р мед. наук, зав. каф. фундаментальной и прикладной микробиологии Башкирского государственного медицинского университета Минздрава России; ufalab@mail.ru
Кулуев Булат Разяпович – канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН; kuluev@bk.ru
Кайданек Тамара Вячеславовна – канд. мед. наук, доц. каф. эпидемиологии Башкирского государственного медицинского университета Минздрава России; tkajdanek@mail.ru


Похожие статьи


Бионика Медиа