Хроническая HBV-инфекция является актуальнейшей проблемой современной медицины. Это обусловлено ее широким распространением (в мире 400 млн инфицированных) и неблагоприятным исходом (более чем у трети больных формируются цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК). По данным ВОЗ, от заболеваний, обусловленных HBV, каждый год умирает в среднем 1 млн человек, а среди всех причин смерти этот вирус занимает 9-е место в мире [1].

Хроническим гепатитом В (ХГВ), несмотря на вакцинацию, болеет примерно от 0,1 до 8% населения. Самая высокая его распространенность отмечена в Китае, Саудовской Аравии, Африке и Бразилии [2–4].

Россия относится к странам с умеренной инфицированностью населения (2–3%), число носителей HBsAg составляет не менее 5 млн человек. В конце прошлого века в связи с распространением инъекционной наркомании в России был отмечен значительный рост заболеваемости гепатитом В (ГВ): в 1991 г. показатель заболеваемости составлял 17,9 на 100 тыс. населения, в 1998 г. – уже 35,7. В следующем десятилетии (1999–2008) благодаря более активной вакцинации населения против ГВ, мерам по борьбе с ВИЧ-инфекцией, более тщательному контролю донорской крови, число новых зарегистрированных случаев острого ГВ уменьшилось. Однако заболеваемость ХГВ, в том числе тяжелыми формами, сохраняется на высоком уровне. Растет число вирус-ассоциированных (микст-инфекции HBV с другими гепатотропным вирусами – HDV и/или HCV) и алкоголь-ассоциированных поражений печени [1].

Хроническая HBV-инфекция характеризуется различными иммунологическими фазами: HBeAg-позитивный хронический гепатит, HBeAg-негативный хронический гепатит и неактивное носительство [5]. У людей с хронической HBV-инфекцией одна фаза может переходить в другую [6, 7]. HBeAg (HBe-антиген) представляет собой вирусный белок, выделяемый HBV. HBeAg-позитивный хронический гепатит – это фаза активного воспаления, которая может привести к циррозу печени [6, 7]. Тем не менее у большинства людей определяется HBeAg-негативный хронический гепатит, который сопровождается фазой неактивного носительства и характеризуется неактивным воспалением, то есть потерей HBeAg, появлением анти-HBe-антител (сероконверсией), а также снижением уровня ДНК HBV [6, 7]. Неактивное носительство – состояние, которое может измениться и в 15–30% случаев перейти в фазу HBeAg-негативного хронического гепатита, где есть активное воспаление без циркуляции HBeAg с умеренным уровнем ДНК HBV от 103 до 108 копий/мл [6, 8]. Последствия HBeAg-негативного хронического гепатита могут быть столь же серьезными или даже тяжелее, чем в случае HBeAg-позитивного хронического гепатита. Причины перехода одной иммунологической фазы в другую неизвестны [6].

ГЦК и цирроз печени являются серьезными осложнениями, связанными с хронической HBV-инфекцией. В целом у около 5% людей с хронической HBV-инфекцией развивается ГЦК [6, 9] и у 6–29% – цирроз печени [10]. Эта информация основана на данных систематических обзоров и мета-анализов, которые показали значительные различия в заболеваемости ГЦК и циррозом печени [9,10].

Цирроз имеет 2 фазы: компенсированный и декомпенсированный цирроз. Для последнего характерны желудочно-кишечные кровотечения из варикозно-расширенных вен пищевода, асцит, энцефалопатия, желтуха или почечная недостаточность [11]. Каждый год у людей с компенсированным циррозом, ассоциированным с HBV, развивается декомпенсированный цирроз (3–5% случаев), ГЦК (2–8%) или наступает смерть (3–4%) [12]. Медиана выживаемости компенсированного заболевания печени составляет более 10 лет, в то время как медиана декомпенсации заболевания печени составляет менее 2 лет [11]. Трансплантация печени является единственным методом лечения, улучшающим качество жизни пациентов с декомпенсированным циррозом печени [13]. Медиана выживаемости после трансплантации печени составляет более 10 лет [14–16].

Современная стратегия лечения ХГВ опирается на несколько фундаментальных представлений о жизненном цикле HBV и течении заболевания. Первое из них свидетельствует о том, что в процессе жизненного цикла вируса формируется особая кольцевая ковалентно замкнутая ДНК (ккзДНК), которая служит матрицей для синтеза прегеномной РНК, а она, в свою очередь, является матрицей для синтеза ДНК HBV под действием обратной транскриптазы. Исследователи полагают, что ккзДНК может длительно сохраняться в ядре гепатоцита. Более того, не отрицается ее ресинтез внутри ядра клетки без активной репликации вируса. Из этого положения следует, что добиться полной элиминации HBV чрезвычайно сложно и, скорее всего, можно только при условии ликвидации всех клеток, несущих в своем ядре ккзДНК [17].

Второе положение, исключительно важное для понимания стратегии лечения ХГВ, – это представление о естественном течении болезни, которое определяет взаимодействие вируса и иммунной системы хозяина (инфицированного человека). Сегодня большинство специалистов считают, что основной целью лечения ХГВ должно быть улучшение качества и продолжительности жизни больных за счёт предотвращения прогрессирования поражения печени с развитием цирроза, декомпенсированного цирроза и рака печени. При этом отмечают, что такая цель может быть достигнута только при устойчивом подавлении репликации HBV [18].

В настоящее время рекомендации по лечению ХГВ Европейской ассоциации по изучению печени (EASL) предусматривают 2 разные стратегии терапии, направленные на исчезновение HBsAg (поверхностного антигена ГВ) или, по меньшей мере, невозможность обнаружения ДНК HBV методом ПЦР [18].

Первая стратегия – лечение с помощью пегилированного интерферона (ПегИФН) в течение ограниченного периода времени (обычно 48 нед.) или аналогами нуклеозидов на неопределенный период времени. Нуклеотидные аналоги – энтекавир и тенофовир – рассматриваются как препараты первой линии терапии с высоким генетическим барьером резистентности, в то время как ламивудин, адефовир и телбивудин рассматриваются как препараты второй линии. В противоположность этому Американская ассоциация по изучению заболеваний печени (AASLD) не рекомендует начинать лечение, если уровень АЛТ менее чем в 2 раза выше нормы при условии отсутствия воспаления или фиброза печени, подтвержденного при биопсии [19]. Препараты первой линии, рекомендуемые AASLD для людей с концентрациями АЛТ, более чем в 2 раза превышающими норму, совпадают с препаратами, рекомендованными EASL, для терапии аналогами нуклеозидов, как минимум, в течение 1 года и продолжении ее после HBeAg-сероконверсии на период от 6 до 12 мес., предпочтительно на 12 мес. Такие препараты, как ИФН, аналоги нуклеозидов [L-нуклеозидов (ламивудин, эмтрицитабин, телбивудин, клевудин)], ациклические фосфонаты (адефовир, тенофовир), циклопентаны (энтекавир), тимозины, или их комбинации применяют для снижения циркулирующих уровней вирусной ДНК, тем самым предотвращая осложнения, связанные с хронической HBV-инфекцией и последующим циррозом печени [6, 7, 20]. ИФН представляют собой белки, секретируемые клетками в ответ на широкий диапазон индукторов и защищающие от вирусов и раковых клеток [21]. Основными видами ИФН являются ИФН-α, ИФН-β, ИФН-ω, ИФН-λ, ИФН-γ [22]. При хронической HBV-инфекции используют ИФН-α [6, 7, 20]. ИФН производят с помощью рекомбинантной технологии, где последовательность ДНК человека сочетается с ДНК бактерий, таких как кишечная палочка [23]. Разновидностью ИФН-α является ПегИФН-α, в котором структура ИФН модифицирована полиэтиленгликолем, что определяет его пролонгированный эффект [24] ИФН-α обычно применяют в виде подкожных инъекций [25].

Тимозины представляют собой семейство полипептидных гормонов, секретируемых вилочковой железой [25]. Тимозин-α или тималфазин обычно производят с помощью рекомбинантной технологии и также вводят подкожно [25–27], остальные противовирусные препараты принимают перорально [7, 25].

Следует отметить, что эти методы лечения имеют значительные побочные эффекты и вызывают осложнения, включая изменения в формуле крови (анемию, нейтропению, тромбоцитопению), нарушение функции почек, а также нервно-психические расстройства, боль в животе, повышение активности печеночных ферментов, миалгии [25].

ИФН является одним из естественных механизмов защиты организма от вирусов [21, 22]. Тимозины способны увеличить количество лимфоцитов и активизировать функцию Т-клеток [26, 27]. Нуклеозидные и нуклеотидные аналоги подавляют репликацию вируса путем ингибирования обратной транскриптазы разными способами [25].

В рекомендациях подчеркивается, что среди пероральных противовирусных средств предпочтение следует отдавать энтекавиру и тенофовиру как препаратам с высоким генетическим барьером к развитию резистентности [28] и с высокой противовирусной активностью.

При HBeAg-позитивном ХГВ лечение энтекавиром или тенофовиром проводят до наступления сероконверсии HBeAg и продолжают еще в течение 12 мес. При этом частота сероконверсии на протяжении 5 лет терапии превышает 50%. Репликация HBV подавляется более чем у 95% пациентов.

При HBeAg-негативном ХГВ длительность лечения энтекавиром или тенофовиром не определена, предполагается, что она должна быть длительной (более 5 лет) и проводиться до наступления сероконверсии HBsAg, а это за указанный срок происходит не более чем в 10% случаев. Репликация HBV контролируется у 98–99 % пациентов. В результате столь длительной терапии отмечен значительный регресс фиброзных и цирротических изменений в печени [29–31].

Таким образом, несмотря на многолетнее изучение заболевания, лечение больных ХГ В по-прежнему остается сложной клинической задачей и в большинстве случаев недостаточно эффективно. До настоящего времени не проведено ни одного сетевого мета-анализа по этой теме, хотя были предприняты попытки сравнения кокрановских систематических обзоров по лечению хронической HBV-инфекции [32–35].

Кроме того, говоря о ХГВ, нельзя обойти вниманием заболевание, вызываемое вирусом гепатита D (HDV), который может реплицироваться только в присутствии HBV. Прогрессирование заболевания является более быстрым и более тяжелым у людей с суперинфекцией HBV/HDV: по последним оценкам, в мире 15 млн человек живут с гепатитом D (ГD), а это около 5% от общего числа больных ГB. Считается, что HDV может продолжать репликацию в присутствии HBsAg и ккзДНК в печени, так что терапия, которая только снижает вирусную нагрузку ДНК HBV, недостаточна, чтобы контролировать распространение HDV.

Лечение больных ГВ/ГD в настоящее время осуществляется только ИФН-α. Эффективность такой терапии крайне низка. Устойчивого вирусологического ответа через 24 нед. после окончания терапии, авиремии, неопределяемого уровя РНК HDV при длительности лечения 48 нед., по данным разных исследований, удается достичь у 10–34,8% больных [1].

Таким образом, на сегодняшний день отсутствуют четкие стандарты ведения пациентов с хронической HBV- и особенно HDV-инфекцией. Современные противовирусные методы лечения ХГВ подавляют репликацию, но малоэффективны для уничтожения самого вируса, в связи с чем большинство пациентов поддерживаются на противовирусной терапии неопределенно длительный срок.

Вот почему крайне актуальным является создание новых лекарственных средств. В настоящее время на стадии разработки находятся препараты с разным механизмом действия и разными точками приложения.

Предполагаемый механизм действия препарата Myrcludex B (инновационный препарат, представляющий собой химически синтезированную пептидную цепочку из 47 аминокислот) заключается в его способности прочно связываться со специфическими (однако до сих пор окончательно не изученными) рецепторами, расположенными на поверхности гепатоцитов, что не позволяет вирусным частицам проникать внутрь клетки. На данный момент это единственный представитель нового класса молекул, обладающих способностью блокировать проникновение вирусных частиц внутрь клетки, защищая таким образом здоровые гепатоциты от инфицирования. К концу 2011 г. были проведены доклинические исследования безопасности разрабатываемого препарата, а также оценка его противовирусной эффективности на моделях in vitro и in vivo. В модели in vivo с трансплантированными гепатоцитами, чувствительными к заражению HBV, применение препарата полностью предотвращало развитие ГВ [36]. В начале 2012 г. завершилось клиническое исследование фазы Ia, которое показало безопасность и хорошую переносимость препарата. В настоящее время проводятся клинические исследования фазы Ib–IIa у пациентов с ХГВ. После 24 нед. лечения Myrcludex B и/или ПегИФН-α-2a, наблюдалось снижение РНК HDV у всех пациентов с ХГВ/ХГD. Отрицательным уровень РНК HDV стал у 2 из 8 пациентов, получавших либо Myrcludex B, либо ПегИФН-α-2a, и у 5 из 7 пациентов, которые получали оба препарата одновременно [37].

В мае 2015 г. на 50-м Международном Конгрессе EASL исследователи из Медицинской школы Университета Анкары представили результаты, полученные после фазы II клинических испытаний LOWR HDV-1, как доказательство правильности концепции исследования препарата лонафарниб в качестве первого перорального препарата для лечения ГD. Лонафарниб ингибирует фарнезилтрансферазу – фермент, который модифицирует белки с помощью процесса, известного как пренилирование. Пренилирование является ключевым шагом в жизненном цикле HDV, и блокирование этого процесса препятствует сборке и упаковке новых вирусных частиц. Надо отметить, что препарат действует не на сам вирус, а против фермента человека-хозяина. В исследование были включены 15 больных с хронической инфекцией HBV/HDV. Лечение продолжалось в течение 4 нед., во время которых определяли эффективность, фармакокинетику и переносимость препарата. Также оценивали результаты комбинированного приема лонафарниба с ритонавиром или ПегИФН. Группам больных назначали лонафарниб в дозировках по 100 мг 3 раза в день, 200 мг 2 раза в день и 300 мг 2 раза в день. После 4 нед. на фоне терапии уровень РНК HDV снизился в среднем на 1,5, 1,6 и 2,0 lg соответственно. Кроме того, снижение вирусной нагрузки происходило быстрее, чем наблюдали в исследовании HIDIT-2 при комбинированном приеме лонафарниба с ИФН и тенофовиром. Наибольшее снижение уровня РНК HDV наблюдалось при приеме лонафарниба в дозировке 100 мг 2 раза в день с ритонавиром и составило в среднем 2,2 lg. Фармакокинетические анализ показал, что ритонавир увеличивал концентрацию лонафарниба в сыворотке крови более чем в 3 раза по сравнению с монотерапией. Среднее снижение было немного ниже в группе больных, получавших лонафарниб и ПегИФН, оно составило 1,8 lg. В течение 2-го месяца лечения уровень РНК HDV продолжал снижаться. После прекращения терапии вирусная нагрузка снова нарастала, но только у 1 пациента вернулась к исходному уровню.

В настоящее время в Турции ведутся клинические исследования LOWR HDV-2 по оценке эффективности комбинированного перорального приема лонафарниба с ритонавиром при более длительных периодах лечения [38].

До сих пор большинство исследователей придерживалось мнения о невозможности клиренса инфицированных гепатоцитов, что очистило бы резервуар ДНК HBV в печени. Весной 2015 г. австралийские ученые, работающие под руководством доктора Марка Пеллегрини в Институте медицинских исследований Уолтера и Элизы Холл при Мельбурнском университете, объявили об успехе доклинических испытаний лекарственного средства против HBV. Учитывая, что само действие HBV считается канцерогенным, исследователи использовали препарат биринапант, созданный для лечения онкологических заболеваний. Он вызывает активацию пускового механизма апоптоза – запрограммированной гибели клеток. Исследования ведутся с апреля 2011 г., их результаты опубликованы на официальном сайте компании-исследователя [39]. Авторы показали, что клеточный ингибитор апоптоза белков (cell Inhibitors of Apoptosis Proteins – cIAPs) ухудшает клиренс HBV, не допуская индуцируемой фактором некроза опухоли (ФНО) гибели инфицированных клеток. Исследования с использованием моделей на животных показали, что ФНО является одним из самых важных цитокинов, способствующих клиренсу HBV [40, 41]. Есть данные, что HBV-инфицированные пациенты с определяемым в сыворотке поверхностным антигеном HBsAg, подвергаются повышенному риску реактивации HBV при лечении антагонистами ФНО [42, 43]. Таким образом, терапевтические средства, усиливающие механизмы, посредством которых ФНО ограничивает распространение HBV, могут быть весьма полезны пациентам с ХГВ. cIAPs нарушает передачу сигналов ФНО, способствуя активации последнего подальше от специфического рецептора, что в свою очередь способствует выживанию клеток и противодействует клеточной гибели, индуцируемой потенциалом ФНО [44].

Ингибиторы cIAPs были разработаны для терапии рака, содействуя ФНО-опосредованному уничтожению первичных раковых клеток в пробирке и в моделях ксенотрансплантатов [45–49]. Эти препараты также известны как Smac-миметики, так как имитируют действие эндогенного белка Smac/Diablo, который является ингибитором сIAPs. С помощью иммунокомпетентных мышиных моделей хронической HBV-инфекции было показано, что биринапант и другие имитаторы Smac способны быстро снижать уровень ДНК HBV и HBsAg в сыворотке и разрушить гепатоциты, содержащие HBcorAg. Выявлено, что эффективность Smac-миметиков в лечении HBV-инфекции зависит от их химического строения, количества CD4+-лимфоцитов и ФНО. Кроме того оказалось, что биринапант усиливает способность энтекавира снижать уровень вирусной ДНК у HBV-инфицированных животных [50].

Для изучения в естественных условиях эффективности Smac-миметиков в лечении HBV-инфекции использовали мышиную модель хронической HBV-инфекции [40, 51, 52]. Мышам внутримышечно вводили плазмиду, содержащую геном HBV, для внесения хронической HBV-инфекции. Разовую дозу биринапанта (10 мг/кг) вводили 7 сут. спустя. Авторы обнаружили, что уровни белка cIAP1 печени понизились в течение 24 ч после инъекции. Аналогичным образом разовая доза препарата была способна снижать уровень cIAP1 в печени мышей. Smac-миметики активизировали протеосомальную деградацию cIAP1 [47, 48]. Через 7 дней после введения биринапанта уровни внутрипеченочного cIAP1 вернулись к исходному значению. После введения животным 2-й дозы препарата уровни протеина cIAP1 снова быстро снижались по сравнению с показателями в контрольной группе животных. Было установлено, что в естественных условиях лечение биринапантом привело к снижению уровня cIAP1 в печени как у наивных, так и у HBV-инфицированных мышей в соответствии с прогнозируемыми эффектами применения этого препарата.

В ходе исследования было выявлено, что CD4+-лимфоциты, обладающие неограниченным количеством рецепторов и способные распознавать HBV и непосредственно участвовать в выработке ФНО, имеют важное значение для эффективности биринапанта в контроле над HBV. При одновременном введении ФНО-нейтрализующих антител вместе с биринапантом HBV-инфицированным животным наблюдали снижение эффективности препарата. Кроме того, уменьшение количества сывороточной ДНК даже после однократного введения биринапанта сопровождалось преходящим повышением уровней трансаминаз, которые в течение 48 ч возвращались к исходному уровню. Увеличение уровней трансаминаз было статистически незначимым и не вызывало существенного повреждения печени [40, 50]. Кроме того, исследователи обнаружили, что сочетание энтекавира и биринапанта было более эффективным и способствовало быстрому клиренсу ДНК HBV в сыворотке крови инфицированных животных. Энтекавир в качестве монотерапии вызывал падение уровня сывороточной ДНК HBV ниже предела обнаружения (500 копий/мл) в течение 4 нед. после 1-го введения, при этом мало влиял на сывороточные уровни HBsAg по сравнению с концентрацией их в контрольной группе животных. В противоположность этому, биринапант, применяемый в качестве монотерапии, снижал уровни и ДНК HBV, и HBsAg в сыворотке крови ниже предела обнаружения в течение 4 нед. лечения. Сочетание этих препаратов хорошо переносилось и приводило к более быстрому исчезновению маркеров HBV-инфекции. Полученные результаты указывают на то, что биринапант и энтекавир, контролирующие HBV-инфекцию через различные механизмы, более эффективны именно при комбинированном применении по сравнению с монотерапией этими препаратами.

Биринапант разрушал клетки печени, инфицированные ГB, оставляя здоровые клетки нетронутыми. Такая терапия восстанавливала апоптоз, биологический механизм гибели поврежденных клеток, который нарушен при ГВ. Таким образом, доклинические исследования указывают на то, что ингибитор сIAP биринапант и, возможно, другие Smac-миметики могут быть эффективны при лечении хронической HBV-инфекции и будут способствовать эффективной элиминации вируса.

Ковалентно замкнутая двухцепочечная ДНК HBV является основной мишенью и для других перспективных препаратов, которые находятся на разных этапах разработки (см. таблицу) и имеют разные механизмы действия [53–55]:

1. Нарушают сборку нуклеокапсида, активны в концентрациях ниже микромолярных. In vitro ускоряют сборку дефектных нуклеокапсидов и ингибирует сборку HBV [56].
2. В эксперименте на животных изменяют экспрессию генов гепатоцитов, тем самым усиливая иммунный ответ на вирусный антиген с участием цитотоксических CD8-лимфоцитов. Препараты вызывают выработку цитокинов мононуклеарными клетками крови. Вероятно, определенную роль играет выработка белков, кодируемых генами, которые стимулируются ИФН. Агонисты toll-подобного рецептора 7 вызывают выраженный гуморальный иммунный ответ в печени. Прямого противовирусного действия препараты не оказывают [57].
3. CR1SPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами; sgRNA – химерная одноцепочечная РНК-проводник; Spy Cas9 (Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein 9) – белок 9, связанный с CRISPR Streptococcus pyogenes. Эндонуклеазы (Spy Cas9) доставляются в клетку с помощью лентивирусного вектора и расщепляют ДНК HBV, а также ковалентно замкнутую двухцепочечную ДНК [58].
4. siRNA (short-interfering RNA) – короткие интерферирующие РНК, блокируют экспрессию генов, в том числе вирусных, на уровне матричной РНК. Основная трудность при разработке таких препаратов – обеспечить доставку siRNA в нужные клетки. С этой целью к siRNA прикрепляют, в частности, поликонъюгаты, с помощью которых удается имитировать механизм доставки вирусной ДНК в клетку-мишень [59].
5. ФНО. ИФН и ФНО в высоких дозах воздействуют на ковалентно замкнутую двухцепочечную ДНК вируса, но слишком токсичны, чтобы применяться у людей. Однако для индукции воспалительной реакции и расщепления вирусной ДНК можно использовать и другие белки из суперсемейства ФНО, которые являются естественными лигандами рецепторов ФНО.

К другим возможным классам препаратов можно отнести нуклеазы с «цинковыми пальцами»; эффекторные нуклеазы, сходные с активаторами транскрипции (transcription activator-like effector nuclease – TALEN); эндонуклеазы генной конверсии (они же хоуминг-эндонуклеазы – homing endonucleases); гелиоксантин; аналоги каудатина; ингибиторы казеинкиназы П [50].

Клинические испытания некоторых препаратов уже проводятся, и возможно в результате их применения через несколько лет мы станем свидетелями избавления человечества от ГВ и многих других внутриклеточных инфекций.