Значительное место среди госпитальных инфекций занимают грамотрицательные неферментирующие бактерии (НФБ), которые характеризуются природной устойчивостью ко многим антибиотикам, высокой резистентностью к дезинфектантам и распространением в стационарах от пациента к пациенту, зачастую с помощью рук медицинского персонала и медицинского оборудования [1]. Среди этой группы микроорганизмов доминируют представители нескольких родов: Pseudomonas, Acinetobacter, Chryseobacterium, Stenotrophomonas, Burkholderia [2]. Частота выделения НФБ достигает 15% от всех аэробных и факультативно анаэробных грамотрицательных бактерий, из них около 70% приходится на долю P. aeruginosa, Acinetobacter spp. и S. maltophilia. [3]. Большое значение такие НФБ, как Pseudomonas aeruginosa и Burkholderia cepacia, имеют при инфекциях нижних дыхательных путей у больных муковисцидозом, у которых они способны вызвать эндокардиты, некротизирующую пневмонию с септицемией, зачастую заканчивающуюся летальным исходом (так называемый «сепация-синдром») [4].

Открытым остается вопрос о способности к образованию биопленки B. сepacia и понятии «Quorum Sensing». Quorum Sensing (QS) – система регуляции экспрессии генов в ответ на увеличение плотности популяции клеток. При изучении данного феномена учеными было обнаружено, что ряд генов, определяющих вирулентность патогенных микроорганизмов и устойчивость к лекарст­венным препаратам, регулируется по принципу QS [5].

Однако до сих пор остается невыясненным вопрос: почему НФБ в одних случаях выделяются из мокроты больных муковисцидозом и не вызывают инфекционных осложнений, а в других вызывают тяжелые поражения легких, нередко с летальным исходом? Поэтому на данный момент изучение изменений микробиологических и культуральных свойств этих микроорганизмов, особенно в системе QS, остается актуальным.

Отличие в «поведении» планктонных и фиксированных микроорганизмов приводит к тому, что в настоящий момент происходит формирование новой ветви профилактической и терапевтической медицины, нуждающейся в разработке фармацевтических и нефармацевтических подходов к лечению заболеваний, вызываемых возбудителями-продуцентами биопленок. В связи с этим актуальным является изучение влияния биотических и абиотических факторов на биопленкообразование бактерий.

Биопленкообразование.

Свойства биопленкообразующих НФБ

В соответствии с современными представлениями, размножение бактерий и существование их в окружающей среде происходит в составе микробных сообществ, которые представляют собой сложный мир, состоящий из структурно организованных сообществ, взаимодейст­вующих между собой и координирующих свои функции путем выделения биологически активных веществ. Наиболее распространенным типом микробных сообществ является биопленка. В жизни микроорганизмов в природе суспензионная или «планктонная» организация популяции, используемая в лабораторных условиях, является только этапом, связанным с фазой распространения популяции и завоевания новых экологических ниш. Формирование различных типов бактериальных сообществ известно со времен Левенгука. Представления об организации микробных пленок можно встретить в работах И.Д. Иерусалимского, который фактически предварил сегодняшние публикации зарубежных авторов. Внимание мирового научного сообщества к этому вопросу привлек в 1978 г. аспирант университета в г. Калгари (США) J. William Costerton. Он разработал метод, который позволил обнаруживать и исследовать биопленки, и показал, что у прикрепленных к субстрату микробных образований экспрессируются иные гены, нежели у свободно живущих отдельных клеток, в результате чего биопленка ведет себя как отдельный «многоклеточный» организм. Микроорганизмы, живущие в составе биопленок, могут вызывать инфекционные заболевания у людей и животных, биодеструкцию материалов, поэтому интерес к биопленкам, существующим в различных экологических системах, включая естественные водоемы, искусственные резервуары и организм человека, продолжает расти. В США, начиная с 2005 г., выпускается журнал «Biofilms», посвященный исследованию биопл енок.

Биопленки представляют собой специфическим образом сформированные сообщества микроорганизмов, составляющие которых выполняют различные функции и имеют единую цель – максимальную адаптацию к данной экологической нише и наиболее эффективное распространение популяции [6].

В составе биопленок клетки бактерий объединены сложными межклеточными связями, осуществляющими регуляцию экспрессии генов в различных частях биопленок, в результате чего популяцию биопленочных бактерий можно рассматривать как функциональный аналог многоклеточного организма. Образование биопленок происходит на поверхностях разного происхождения как в природе, так и в организме хозяина [7]. Различные виды бактерий используют QS для скоординированного ответа, согласованного с локальной плотностью их популяции. Системы регуляции генов типа QS играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями как при патогенезе, так и при симбиозе. Впервые феномен регуляции генов по типу QS был обнаружен в 1970-е годы у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы Zwx-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток. Однако термин «QS» был впервые введен в обиход значительно позже – в 1994 г. – Е.Р. Greenberg с сотрудниками. В результате активного изучения было обнаружено, что феномен QS широко распространен среди бактерий. Оказалось, что ряд генов, определяющих вирулентность патогенных микроорганизмов и устойчивость к лекарст­венным препаратам, регулируется по принципу QS. [8] В настоящее время QS-регуляция обнаружена более чем у 50 видов бактерий [6].

Этапы формирования биопленки

Этап 1. Обратимое прикрепление к поверхности. Чаще всего микроорганизмы существуют в виде свободно плавающих масс или единичных (например, планктонных) колоний. Однако в нормальных условиях большинство микроорганизмов стремятся прикрепиться к поверхности и, в конечном счете, образовать биопленку.

Этап 2. Перманентное прилипание к поверхности. По мере размножения бактерий они более прочно прилипают к поверхности, дифференцируются, обмениваются генами, что обеспечивает их выживаемость.

Этап 3. Формирование слизистого защитного матрикса/биопленки. Однажды устойчиво присоединившись, бактерии начинают образовывать экзополисахаридный окружающий матрикс, известный как внеклеточное полимерное вещество (extracellular polymeric substance). Это предохранительный матрикс или «слизь» (EPS-matrix). Мелкие колонии бактерий затем образуют первоначальную биопленку. Cостав матричной слизи варьирует в соответствии с тем, какие именно микроорганизмы в нем присутствуют, но в основном в него входят полисахариды, белки, гликолипиды и бактериальная ДНК [7]. Матрикс пронизан каналами, по которым циркулируют питательные вещества, продукты жизнедеятельности, ферменты, метаболиты и кислород [9]. В сообществе биопленки разные бактерии нередко тесно связаны, поскольку выполняют разные, но полезные друг для друга функции. Продукты обмена веществ (по сути, отбросы) одних бактерий могут использоваться другими в качестве основного источника пищи, причем иногда реакция, осуществляемая первой группой организмов, может протекать только при условии изъятия из среды конечного продукта второй группой. Все биопленки имеют свои микросреды, различающиеся уровнями рН, усваиванием питательных веществ, концентрациями кислорода. Матрикс у разных видов бактерий неодинаков по физическим свойствам и химическому составу, но, как правило, представляет собой анионный полимер. ЭПС матрикса состоит в основном из гомо- и гетерополисахаридов. В состав ЭПС входят уроновые кислоты, главным образом, глюкуроновая, и аминосахара. Показано, что ЭПС матрикса защищает бактерии в биопленке от антибактериальных препаратов, повреждающих факторов внешней среды, таких как УФ-свет, радиация, изменения рН, осмотический шок, высыхание. ЭПС сорбирует металлы и минералы, растворенные органические вещества, концентрирует питательные вещества, ферменты и ростовые факторы. ЭПС матрикса играет важную роль, фиксируя и закрепляя бактерии в тех экологических нишах, где существует угроза смыва [10].

В последнее время установлено, что более чем в 80% случаев инфекционные поражения организма проходят в форме биопленочной инфекции [11]. Среди возбудителей, образующих биоленки, наи­большее клиническое значение имеют P. aeruginosa, S. aureus, K. pneumoniae, Coagulasa-negative staphylococcus, Enterococcus spp., Candida spp. [12]. Все больший интерес представляют исследования по биопленкообразующей способности грамотрицательных НФБ. Так, патогенность Burkholderia cepacia связана и со способностью образовывать вязкие биопленки в бронхах и легких больного человека, особенно у людей со сниженным иммунитетом и у детей с наследственным кистозным фиброзом. [13] Более того, Burkholderia cepacia могут образовывать биопленки в ассоциации с P. aeruginosa, вызывая еще более тяжелые поражения легких у больных муковисцидозом [14].

Резистентность биопленок к различным биоцидам первоначально объяснялась ограничением движения микроорганизмов, связанных с материалом матрикса. Однако скоро было показано, что матрикс биопленки реагирует с биоцидом только в том случае, когда молекула биоцида вступает в реакцию с материалом матрикса. Помимо устойчивости к антибиотикам и антисептикам, биопленки резистентны и к ионам металлов, включая медь и серебро. Дикие штаммы многих видов бактерий интенсивно колонизируют поверхности этих металлов. В течение ряда лет опробовано множество методов, направленных на удаление и/или предотвращение образования бактериальных биопленок на клинически значимых поверхностях, включая использование биоцидов и антибиотиков, ультразвука, ферментативного воздействия и т. д. Все они имели переменный и, как правило, временный успех. Особенно сложно процесс поиска проходит в области предотвращения инфицированности биомедицинских устройств. По мнению Н.В. Белобородовой и соавт. [6], в изучении эффективности любых антимикробных веществ существует не устраненый на сегодняшний день парадокс: все исследования выполняются в лабораториях на чистых культурах бактерий, выращенных в богатых питательными веществами средах и в планктонном виде. В действительности ничто не может быть дальше от естественных условий, в которых эти микроорганизмы находятся в организме тяжелых пациентов, подвергающихся антимикробной терапии. На сегодняшний день можно сказать почти с полной уверенностью, что для большинства бактерий состояние биопленки, прикрепленной к поверхности, – базовое, выработанное в течение миллионов лет под влиянием естественного отбора в меняющихся экологических условиях [6].

Следствием защищенности микроорганизмов, находящихся в биопленке, является их недоступность для клеточных (агрегация микробов делает структуру более объемной и недоступной для фагоцитоза) и гуморальных (ключевые антигены закрыты для антител внеклеточным матриксом) факторов защиты макроорганизма, а также их фенотипическая устойчивость к антимикробным препаратам (АМП), что и составляет основу проблем терапии хронических и рецидивирующих инфекций. Установлено, что чувствительность фиксированной формы возбудителей к антибиотикам значительно меньше таковой у планктонной формы, что связано как с наличием матрикса, через который АМП должны еще пенетрировать, так и с тем, что большинство микроорганизмов биопленки находятся в неактивной фазе жизненного цикла, в то время как антибиотики в большинстве своем нацелены на метаболически активные клетки. Именно поэтому парадоксом является практика определения чувствительности к антибиотикам именно планктонных микроорганизмов, в то время как выявленные минимальные подавляющие концентрации и установленные на их основе дозы препаратов могут быть совершенно неадекватными для борьбы с возбудителями, находящимися в биопленке. Тем не менее некоторые АМП для местного применения характеризуются хорошей пенетрацией в биопленки и высокой клинической эффективностью в терапии хронических и рецидивирующих инфекций. Так, ирригация полости носа мупироцином при хроническом риносинусите, вызванном метициллинрезистентным стафилококком (MRSA), вела к элиминации биопленок у 41 из 42 (97,6%) пациентов, включенных в исследование. Среди препаратов для системного использования наилучшей пенетрацией в биопленки в целом обладают фторхинолоны и фосфомицин. Способом улучшения пенетрации в биопленку может являться и совершенствование форм доставки АМП. Известно, что липосомальный комплекс амфотерицина B обладает выраженной активностью по отношению к резистентным биопленкам, продуцируемым Candida spp., что позволяет использовать его при инвазивных системных микозах [15].

Эффективным средством инактивации природной биопленки, состоящей из аэробных гетеротрофов и сульфатредуцирующих бактерий, является холодная плазма. В лабораторных экспериментах установлено, что в условиях прямого контакта между активными частицами плазмы и биопленкой можно добиться достаточно быстрой и полной гибели микроорганизмов. Показана возможность воздействия на процессы формирования биопленок таких ферментов, как вобэнзим и папаин, которые в небольших концентрациях могут не только частично угнетать образование биопленок, но и усиливать действие на них различных антибиотиков. Надежду внушают исследования, касающиеся действия бактериофагов на биопленки.

Однако остаются нерешенными вопросы:

• как вирулентность микроорганизмов связана с биопленкообразованием?
• можно ли, воздействуя на симбионтов для псевдомонад, добиться элиминации самого возбудителя?
• методы изучения биопленкообразования in vitro... Насколько эти модели соотносимы с истинным положением вещей?