В последние годы отмечается увеличение числа новых генотипов риккетсий, что связано с совершенствованием методов их идентификации.

При исследовании клещей I. persulcatus, собранных в Тюкалинском районе Омской области, с помощью гемоцитового теста [1] и метода флюоресцирующих антител с иммуноглобулинами диагностическими люминесцирующими для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) и риккетсий группы сыпного тифа выявлено, что 23 ± 4,2% из них содержали риккетсии [2]. При дальнейших исследованиях с использованием методов молекулярно-биологического анализа в клещах I. persulcatus, собранных в России, описан новый генотип риккетсий – Candidatus Rickettsia tarasevichiae, названный в честь академика Ирины Владимировны Тарасевич [3].

Цель исследования – анализ имеющихся к настоящему времени данных изучения кандидата в новые виды Candidatus Rickettsia tarasevichiae.

Материалы и методы

В работе использован комплекс риккетсиологических, серологических, молекулярно-генетических методов.

Сбор иксодовых клещей проводили на стандартную волокушу. С помощью молекулярно-биологических методов (ПЦР-секвенирование) исследовано 317 экземпляров клещей I. persulcatus, собранных с растительности в Челябинской, Томской, Омской и Новосибирской областях, Алтайском, Красноярском и Приморском краях. Для выделения штаммов риккетсий в 2003 г. индивидуально исследовано 79 экземпляров клещей I. persulcatus из лесостепи Омской (Подгородка) и Новосибирской (Усть-Тарка) областей и горно-таежной зоны Красноярского края (заповедник «Столбы»).

Культивирование риккетсий проводили по методике, указанной ранее [4, 5]. Культуральные флаконы с инфицированными клетками культивировали в углекислотном термостате при температуре 37 оС в течение 8–16 суток. После завершения инкубации флаконы подвергали замораживанию в низкотемпературном холодильнике при -20 оС, а потом оттаиванию для разрушения клеток и максимального выхода из них риккетсий. После оттаивания материал центрифугировали в течение 10 мин. при 3000 об/мин. Супернатант в объеме 0,5 мл брали в следующий пассаж, а из 0,2 мл делали мазки; остатки супернатанта хранили в криопробирках в низкотемпературном холодильнике.

Полученные образцы исследовали методом флюоресцирующих антител по стандартной методике, используя иммуноглобулины диагностические для выявления риккетсий группы КПЛ, люминесцирующие сухие (НПО «Биомед», Россия). Изучение морфологических и тинкториальных свойств риккетсий проводили в соответствии с рекомендациями П.Ф. Здродовского и Е.М. Голиневич [6].

Однораундовую ПЦР проводили с применением праймеров, амплифицирующих фрагменты генов цитратсинтазы (gltA), 16S рибосомальной РНК и поверхностного мембранного белка 190 кДа (omp A) с последующим секвенированием положительных образцов ДНК [3].

Воспроизведение экспериментальной инфекции проводили в биопробах на морских свинках-самцах весом 300–350 г. путем внутрибрюшинного введения 2,0 мл 10–20% суспензии лиофилизированных штаммов, полученных на культурах клеток. В работе использованы штаммы «Усть-Тарка–10/2003», «Усть-Тарка–34/2003», «Подгородка-22/2003», «Подгородка-27/2003». Каждым штаммом было заражено по 3 морских свинки.

Результаты и обсуждение

Молекулярно-биологические исследования

Полученные последовательности нуклеотидов составили 1322 п.о. для гена 16S рибосомальной РНК и 1196 п.о. – для гена цитратсинтазы (gltA). При сравнении их с имеющимися в Genbank они показали свою уникальность и имели наибольший процент гомологии с Rickettsia canadensis: 98% соответствия по гену 16S рибосомальной РНК и 96% гомологии по гену gltA (номера Genbank AF 503168 и AF 503167 соответственно). Для гена gltA установлено 38 различий в нуклеотидах с Rickettsia canadensis, по гену 16S рибосомальной РНК – 19. По действующим критериям таксономии риккетсий [7], данный генотип не принадлежит к группам КПЛ и СТ и не может быть отнесен ни к одному из известных видов рода Rickettsia.

Определена высокая инфицированность клещей I. persulcatus этим микроорганизмом на ряде территорий России: в Челябинской, Томской, Омской и Новосибирской областях, Алтайском, Красноярском и Приморском краях. Этот риккетсиальный агент был обнаружен у 81 из 317 исследованных клещей I. persulcatus: от 1 из 26 экземпляров клещей в Новосибирской области до 56,8 ± 7,5% в Приморском крае. Следовательно, впервые с помощью молекулярно-биологических методов доказано присутствие риккетсий в клещах рода Ixodes в России. ДНК Candidatus R. tarasevichiae обнаружена в 25,5 ± 2,4% имаго I. persulcatus, собранных на территориях от Южного Урала до Дальнего Востока.

Вероятно, географическое распространение этого вида риккетсий совпадает с ареалом I. persulcatus, которые заселяют биотопы южной тайги и смешанных лесов в Евразии от западных границ России до Дальнего Востока. Эту гипотезу подтверждают находки Candidatus R. tarasevichiae в клещах этого вида в Вологодской области [8], Республике Коми [9] и на других территориях.

Проведенный филогенетический анализ генов 16S рибосомальной РНК и gltA известных видов риккет­сий показал, что Candidatus R. tarasevichiae вместе с R. canadensis и новыми «риккетсиями насекомых» Adalia bipunctata (AB) Bacterium, Adalia decempunctata (AD) Bacterium, Pea Aphid rickettsia образуют отдельный кластер в пределах рода Rickettsia [3].

Считается, что изучение гена оmpA ориентировано и наиболее оправдано при изучении риккетсий группы КПЛ [10]. При этом применение гена gltA наиболее эффективно для риккетсий группы СТ, R. helvetica, кластера R. australis – R. akari, а также кластера R. canadensis. Так, P.-E. Fournier и соавт. [11], применяя обширный набор праймеров, не смогли амплифицировать фрагменты гена оmpA у R. australis, R. helvetica, R. akari, R. bellii. В связи с этим долгое время оставалась неизученной нуклеотидная последовательность гена оmpA для Candidatus R. tarasevichiae.

В 2011 г. из иксодовых клещей на северо-востоке Китая выделена ДНК риккетсий и описана последовательность ompA Rickettsia sp. H820 (JF 714220). По данным Т.П. Микрюковой и соавт. [12], пробы ДНК из клещей I. persulcatus и образцов органов птиц из Томской области, которые по гену gltA кластеризовались с Candidatus R. tarasevichiae, по гену ompA оказались в одной ветви с последовательностью Rickettsia sp. H820. Аналогичные данные были получены в дальнейшем китайскими исследователями [13] при изучении проб ДНК из клещей I. persulcatus и биоматериалов от пациентов после присасывания клещей в северо-восточной провинции Муданьцзян (Mudanjiang), а также нами при исследовании клещей I. persulcatus, снятых с пациентов в Омской области. Следовательно, с достаточной вероятностью можно предположить возможность наличия фрагментов гена ompA у Candidatus R. tarasevichiae, что требует дополнительного изучения на штаммах, выделенных в различных частях ареала I. persulcatus.

К настоящему времени описано еще как минимум 2 представителя группы предшественников, близкородственных R. canadensis (и Candidatus R. tarasevichiae) – Rickettsia monteiroi sp. nov. [14] и Candidatus Rickettsia kingi [15].

Rickettsia monteiroi sp. nov. изолирована на культуре клеток Vero из клещей Amblyomma incisum, собранных с растительности в штате Сан-Пауло (Бразилия) в 2004–2006 гг. Методом ПЦР получены фрагменты длиной 1089 (ген gltA), 457 (ген белка 17 кДа, htrA), 1362 (ген 16S рибосомальной РНК, rrs), 443 нуклеотидов (ген белка-автотранспортера, sca1); продукта к гену поверхностного мембранного белка 190 кДа (omp A) не получено. Молекулярно-биологический анализ фрагментов генов показал, что по фрагменту гена gltA наибольшая (96,1%) гомология отмечена с Candidatus R. tarasevichiae, далее – с R. canadensis (95,8 %). По фрагменту гена 16S рибосомальной РНК наибольшее (99,1%) сходство отмечено с Rickettsia bellii, по генам htrA и sca1 – с R. canadensis (89,8 и 95,2% соответственно). Указанные фрагменты у Candidatus R. tarasevichiae не были описаны. Авторы указали на отсутствие выраженных перекрестных реакций между Rickettsia bellii, Rickettsia monteiroi, R. rickettsii и R. canadensis в опытах с сыворотками крови инфицированных соответствующими видами риккетсий морских свинок. Авторы [14] относят описанный ими новый вид Rickettsia monteiroi sp. nov. к группе Canadensis вместе с R. canadensis и Candidatus R. tarasevichiae.

Candidatus Rickettsia kingi была выявлена в клещах Ixodes kingi, снятых с Thomomys talpoides в канадской провинции Саскачеван (Saskatchewan) в 2011 г. с помощью ПЦР-секвенирования без изоляции риккетсии [15]. Наибольшая гомология установлена по гену ompA с Rickettsia sp. H820 (у Candidatus R. tarasevichiae фрагменты этого гена описаны не были) – 94,5%, по гену gltA – с Candidatus R. tarasevichiae (99,1%), по гену белка 17 кДА – с R. canadensis (94,9%), по гену 16S рибосомальной РНК – с риккетсиальным эндоцитобионтом каменного жука, Coccotrypes dactyliperda (99,3%), с риккетсиями группы КПЛ – 99,1–98,9%, с Candidatus R. tarasevichiae – 98,8% и с R. canadensis – 98,4%. По данным этих авторов, Candidatus R. kingi не принадлежит к группам КПЛ и сыпного тифа и образует сестринский таксон по отношению к R. canadensis и Candidatus R. tarasevichiae. Из риккетсий этой группы фрагменты гена ompA выявлены у R. canadensis, Rickettsia sp. H820 (относится к Candidatus R. tarasevichiae), Candidatus R. kingi; не выявлены – у Rickettsia monteiroi. Требуется более подробное молекулярно-биологическое описание Candidatus R. tarasevichiae на штаммах по всем генам, использованным для описания других близкородственных риккетсий.

R. canadensis (штамм 2678) была изолирована из клещей Haemaphysalis leporispolustris в Канаде (провинция Онтарио) в 1963 г. [16]. Позднее антитела к R. canadensis были выявлены у 4 пациентов с клиникой пятнистой лихорадки Скалистых гор в США (в Техасе и Северной Каролине) [17]. Эта риккетсия также является ответственной за случаи острого церебрального васкулита в Северной Америке [18, 19]. В связи с этим можно предположить, что Candidatus R. tarasevichiae может оказаться патогеном и быть ответственной за случаи инфекций с клинической картиной, нетипичной для известных клещевых инфекций, которые регистрируются в ареале клещей I. persulcatus.

Серологические и молекулярно-биологические исследования

По результатам проведенных нами исследований [20] был сделан вывод, что на территории России значительная часть неверифицируемых острых лихорадочных заболеваний людей, контактировавших с иксодовыми клещами, обусловлена патогенами рода Rickettsia. По данным ИФА, среди больных с клиникой клещевого риккетсиоза из эндемичных территорий Алтайского края IgM-антитела к Candidatus R. tarasevichiae выявлены в 10,8 ± 3,8% случаев, IgG-антитела – в 4,6%. IgM-антитела к Candidatus R. tarasevichiae выявлены у лихорадящих больных после присасывания иксодовых клещей и на севере Омской области, неэндемичном по клещевым риккетсиозам, но на территориях которого доказана инфицированность таежных клещей этой риккетсией [21].

К указанным данным о возможности инфицирования населения Сибири Candidatus R. tarasevichiae следует добавить данные китайских исследователей [13]. Ими при обследовании в 2012 г. в северо-восточной провинции Муданьцзян 251 пациента, находившегося на стационарном лечении после присасывания иксодовых клещей, выявлена ДНК Candidatus R. tarasevichiae при ПЦР-секвенировании проб биологического материала (кровь, кожные биоптаты) от 5 человек.

Изучение фенотипических свойств

Фенотипические свойства Candidatus R. tarase­vichiae в настоящее время описаны не полностью. В связи с этим нами были изучены особенности культивирования новой риккетсии на биологических моделях: культуре клеток Vero, а также на морских свинках при внутрибрюшинном заражении.

Из 58 экземпляров клещей, собранных в окрестностях с. Подгородка Омской области, в 37 экземплярах методом РНИФ были обнаружены риккетсиоподобные микроорганизмы. Все 58 экземпляров взяты для культивирования в культуре клеток Vero.

11 иксодовых клещей из окрестностей Красно­ярска, минуя гемоцитовый тест, были взяты для исследования в культуре клеток Vero.

40 экземпляров клещей из Новосибирской области были исследованы с использованием гемоцитового теста. Методом РНИФ в 18 экземплярах были обнаружены риккетсиоподобные микроорганизмы, 10 из которых были взяты для культивирования в культуре клеток Vero.

Весь материал культивировали на протяжении 4 пассажей. После каждого пассажа материал исследовали на наличие риккетсий (РНИФ), а также изучали морфологические и тинкториальные свойства [6]. В мазках риккетсиоподобные микроорганизмы окрашивались в ярко-розовый или рубиново-красный цвет, цитоплазма клеток – в голубой, ядра – в синий. В культуре клеток Vero наблюдалось умеренное накопление риккетсий до 5–7 экземпляров в поле зрения, преимущественно в цитоплазме клеток.

Полученные штаммы подвергали лиофильному высушиванию. При исследовании молекулярно-биологическими методами 13 изолятов из окрестностей с. Подгородка во всех была обнаружена ДНК риккетсий, 6 изолятов идентифицированы как относящиеся к новому генотипу риккетсий – Candidatus R. tarasevichiae. Из 9 изолятов, полученных из Усть-Таркского района Новосибирской области, 7 были идентифицированы как Candidatus R. tarasevichiae. При исследовании 6 проб, полученных из заповедника «Столбы» Красноярского края, в 4 пробах выявлена Candidatus R. tarasevichiae, в 2 пробах ДНК риккетсий не обнаружена. При идентификации в Genbank полученная последовательность фрагмента гена цитратсинтазы имела 100% гомологии с Candidatus R. tarasevichiae. 8 штаммов Candidatus R. tarasevichiae были депонированы во Всероссийский музей риккетсиозных культур НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (Москва).

При внутрибрюшинном заражении самцов морских свинок лиофильно высушенными штаммами Candidatus R. tarasevichiae была воспроизведена доброкачественная экспериментальная инфекция, клинически проявляющаяся незначительным повышением ректальной температуры (до 39,6 оС) на 4–7-й день после заражения и характеризующаяся незначительным увеличением и гиперемией селезенки, печени и тестикул, а также выраженной гиперемией мозга и мозговых оболочек. При микроскопии мазков-отпечатков из лимфатических узлов, влагалищных оболочек яичек и легких, окрашенных по методу Здродовского, наблюдали незначительное накопление риккетсиоподобных микроорганизмов; в мазках из селезенки отмечалось до 10–15 экземпляров в поле зрения. Наибольшее количество риккетсиоподобных микроорганизмов (более 50 экземпляров в поле зрения) отмечалось в мазках из мозга. Риккетсии выявляли преимущественно в цитоплазме клеток исследованных органов. Мозг морских свинок, инфицированных Candidatus R. tarasevichiae, взят для культивирования на клеточной культуре Vero.

Культивирование риккетсий в культуре клеток Vero проводили на протяжении 3 пассажей. Поскольку наибольшее накопление биомассы риккетсий наблюдается в условиях пониженного метаболизма клеток хозяев, нами были подобраны оптимальные условия культивирования. Для этого мы увеличили время инкубации зараженных клеток с 7 до 14 суток. При бактериоскопии мазков, окрашенных по методу Здродовского, было выявлено, что количество риккетсиоподобных микроорганизмов при инкубации в течение 7 суток составляло от 5 до 7 экземпляров в поле зрения. После увеличения времени инкубации число риккетсиоподобных микроорганизмов увеличилось до 25–30 экземпляров в каждом поле зрения с преимущественной локализацией микроорганизма в цитоплазме клеток.

Выводы

Показано, что фрагменты генов ompA и gltA у Rickettsia sp. H820 имеют высокую (близкую к 100%) гомологию с соответствующими фрагментами генов Candidatus R. tarasevichiae. Для окончательного описания таксономического положения требуется более подробное молекулярно-биологическое описание Candidatus R. tarasevichiae по генам, использованным для описания других близкородственных риккетсий.

С использованием культуры клеток Vero впервые изолированы штаммы Candidatus R. tarasevichiae и изучены особенности их культивирования. В опытах на морских свинках-самцах показано, что лиофилизированные культуры Candidatus R. tarasevichiae вызывают нелетальную экспериментальную инфекцию с преимущественным поражением сосудов головного мозга.

По данным ИФА, у больных с клиникой клещевого риккетсиоза из Алтайского края выявлены IgM- и IgG-антитела к Candidatus R. tarasevichiae, что свидетельствует о возможности инфицирования населения этой риккетсией. С учетом полученных данных можно заключить, что в ареале клещей I. persulcatus – основного хозяина Candidatus R. tarasevichiae – необходима дифференциация различных нозологических форм трансмиссивных заболеваний, в том числе риккетсиозов, у пациентов с неясными лихорадками после присасывания иксодовых клещей.