A new approach to comprehensively assessing immunobiological responsiveness in a cohort to be vaccinated (revaccinated) against brucellosis


Ponomarenko D.G.

Stavropol Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare
This paper describes a new approach to comprehensively assessing immunobiological responsiveness in a cohort to be vaccinated (revaccinated) against brucellosis, which is based on in vitro leukocyte antigen activation methods and flow cytometry technology. To estimate the intensity of post-vaccination antibrucella immunity, the authors recommend the use of a modified lymphocyte blast transformation reaction to detect blast cells by anti-CD34+ monoclonal antibodies, by further taking into account the results of the reaction using a flow cytometer. To identify hypersensitivity (allergization) to Brucella antigens, it is recommended to use the basophil activation test and a flow cytometric immunophenotyping test to estimate the expression of the degranulation marker CD63+.

Бруцеллез остается одной из наиболее актуальных опасных инфекций в регионах с развитым животноводст­вом. Исключительный полиморфизм симптомов, многообразие форм болезни, частое развитие органных поражений при хроническом бруцеллезе, приводящих к инвалидизации лиц трудоспособного возраста, недостаточная эффективность существующих методов диагностики, профилактики и лечения этого заболевания определяют актуальность данной инфекционной патологии [1, 2].

Основой специфической профилактики бруцеллеза является вакцинация. Согласно санитарно-эпидемиологическим правилам СП 3.1.7.2613-10 «Профилактика бруцеллеза» [3], профилактические прививки против этого заболевания входят в национальный календарь прививок по эпидемическим показаниям. Вакцинация проводится в очагах козье-овечьего типа лицам, достигшим 18 лет и выполняющим работы по заготовке, хранению, обработке сырья и продуктов животноводства, полученных из хозяйств, где регистрируются заболевания скота бруцеллезом; по убою скота, больного бруцеллезом; животноводам, ветеринарным работникам, зоотехникам в хозяйствах, энзоотичных по бруцеллезу; работникам бактериологических лабораторий, работающим с живыми культурами.

Для иммунизации людей против бруцеллеза применяется вакцина, приготовленная из вакцинного штамма B. abortus 19 ВА, которая способствует сохранению напряженного иммунитета в течение 5–6 месяцев; ревакцинация групп риска осуществляется через 10–12 месяцев. Вакцинации подлежат лица с четкими отрицательными серологическими и аллергическими реакциями на бруцеллез [3].

В соответствии с методическими указаниями МУ 3.1.7.1189-03 «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей», для оценки напряженности противобруцеллезного иммунитета в настоящее время используются реакции, основанные на выявлении специфических антител (РПГА, ИФА) [4]. Однако ряд исследователей [5–7] указывают на ведущую роль в защите организма от бруцелл клеточного звена иммунитета, соответственно серологические методы только косвенно могут указывать на напряженность противобруцеллезного иммунитета.

Согласно нормативной документации [4], повышенную чувствительность организма человека к бруцеллам выявляют с помощью кожно-аллергической пробы с бруцеллином (проба Бюрне) и реакции лейкоцитолиза (РЛ).

Постановка пробы Бюрне имеет ряд недостатков. У лиц, высоко сенсибилизированных к бруцеллезному антигену, возможно развитие реакции в виде повышения температуры, озноба, головной боли, лимфангита, артралгии и т. д. К недостаткам можно отнести риск возникновения ложноположительного результата при наличии в анамнезе аллергии. Учет реакции осуществляется через 48–72 ч [4]. Имеются сведения о низкой чувствительности и слабой специфичности РЛ при выявлении сенсибилизации к возбудителям инфекции [8]. Это, вероятно, связано с тем, что доминирующие механизмы развития инфекционной аллергии обусловлены Т-клеточным звеном иммунитета, а в РЛ осуществляется недифференцированный подсчет лейкоцитов.

Учитывая, что эпидемиологическая эффективность вакцинации против бруцеллеза зависит от правильного определения показаний к ее проведению, полноты отбора подлежащих иммунизации профессиональных групп, в том числе временного персонала, а также от объективности подходов к анализу результатов специфической профилактики, необходима модернизация методов оценки уровня сенсибилизации и напряженности иммунитета у лиц, подлежащих вакцинации и ревакцинации.

В последние годы повышенная чувствительность к антигену и напряженность поствакцинального иммунитета все чаще оценивается in vitro с использованием технологий проточно-цитометрического анализа клеток [5, 6, 9, 10].

В многочисленных исследованиях отечественных и зарубежных авторов [11–16] продемонстрирована высокая эффективность применения методов антигенной активации лейкоцитов in vitro для выявления сенсибилизации и уровня специфической невосприимчивости организма к патогенам.

Учитывая вышеизложенное, весьма актуальными и востребованными являются разработка и внедрение в практику принципиально новых подходов к оценке in vitro напряженности клеточного иммунитета и повышенной чувствительности (аллергизации) организма к возбудителю бруцеллеза.

Цель работы – разработка нового подхода к оценке степени аллергизации и напряженности иммунитета у лиц, подлежащих вакцинации против бруцеллеза.

Материалы и методы

Обследовали 67 человек, из них 24 первично вакцинированых против бруцеллеза – на 30-е сутки после иммунизации и 27 – через 12 месяцев после вакцинации. Контрольную группу составили 16 человек, не имевших в анамнезе симптомов аллергии, не больных и не переболевших бруцеллезом и не вакцинированных против этой инфекции.

Наличие и интенсивность аллергической реакции к возбудителю бруцеллеза определяли по экспрессии базофилами маркера активации CD63+, используя набор Flow-CAST® («Buhlmann laboratories», Швейцария) [6]. Напряженность клеточного иммунитета к возбудителю бруцеллеза выявляли с помощью реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) [7] с модернизированным нами способом учета результатов реакции, заключающейся в детекции бластных форм лимфоцитов моноклональными антителами к маркеру гемопоэтических бластных клеток CD34+ («Beckman Coulter», США) с последующим проточно-цитометрическим анализом образца. В качестве специфического антигена бруцелл использовали бруцеллин (НПО «Микроген», Россия). Цитометрический анализ был проведен с помощью проточного цитофлуориметра FACS Calibur («Beckton Dickinson», США).

Обеззараживание исследуемого материала осуществляли в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)» [17] путем добавления к исследуемой пробе мертиолята натрия до конечной концентрации 1:10 000 с последующим прогреванием при 56 °С в течение 30 мин.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для выявления статистической значимости различий результатов использовали t-критерий Стьюдента при уровне достоверности p ≥ 0,95.

Результаты и обсуждение

Выявленная в ходе исследования динамика показателей активации базофилов (СD63+) бруцеллином представлена на рис. 1.

В контрольной группе уровень активированных бруцеллином базофилов в среднем составил 2,38 ± 0,37% (0,12– 4,74%).

При изучении чувствительности к возбудителю бруцеллеза на 30-е сутки после вакцинации установлена выраженная аллергизация антигенами бруцелл организма привитых, среднее количество активированных бруцеллином базофилов составило 19,03 ± 1,42% (11,99–27,64%).

Через 12 месяцев после проведения профилактических противобруцеллезных прививок у 35,3% обследованных выявлена повышенная чувствительность к возбудителю бруцеллеза: уровень активированных бруцеллином базофилов составлял в среднем 10,31 ± 1,19% (6,74–14,5%).

При постановке РБТЛ с иммуннофенотипическим учетом результатов в контрольной группе количество бластных форм лимфоцитов до и после активации бруцеллином не имело статистически значимой разницы, составив в среднем 0,52 ± 0,12 и 0,59 ± 0,11% соответственно (рис. 2).

Анализ напряженности клеточного противобруцеллезного иммунитета в РБТЛ у лиц, обследованных на 30-е сутки после вакцинации, позволил установить повышение специфической клеточной сенсибилизации, что выражалось в статистически значимом увеличении количества бласт-трансформированных лимфоцитов при активации бруцеллином с 0,84 ± 0,07 до 5,80 ± 0,48% (3,21–9,17%).

Через 12 месяцев после вакцинации наличие выраженного клеточного иммунитета к возбудителю бруцеллеза было выявило у 23,5% привитых. При этом у 76,5% уровень клеточной активации бруцеллином был значительно ниже, чем в группе вакцинированных, обследованных на 30-е сутки после иммунизации (1,91 ± 0,17%), однако выше показателей в контрольной группе (0,59 ± 0,11 %; см. рис. 2).

Для выявления степени сенсибилизации макроорганизма перспективным объектом исследования являются базофилы, которые играют центральную роль в реакциях гиперчувствительности немедленного типа. Специфическая особенность базофилов подобным образом реагировать при взаимодействии с аллергенами стала основой для разработки предложенного метода in vitro оценки активации базофилов бруцеллином с последующей детекцией результатов реакции с помощью проточной цитофлуориметрии.

Одним из основных признаков активации лимфоцитов является интенсивность пролиферативной активности в РБТЛ. Данные показатели объективно отражают способность сенсибилизированных лимфоцитов к пролиферации и дифференцировке в ответ на антигенный стимул и характеризуют функциональное состояние активированных Т-лимфоцитов, что можно использовать как маркер, указывающий на степень повышенной чувствительности, а соответственно и напряженности иммунитета. Интенсивность пролиферативного ответа лимфоцитов на антигены дает представление о выраженности специфической сенсибилизации организма.

Таким образом, предложена новая методика оценки напряженности иммунитета против бруцеллеза, которая значительно упрощает учет и увеличивает объективность результатов РБТЛ за счет использования высокоспецифичных моноклональных антител против CD34+ и проточно-цитометрического анализа.

Разработанный метод количественной оценки специфической сенсибилизации макроорганизма к возбудителю бруцеллеза in vitro, позволяет осуществлять постановку и учет реакции в течение двух часов, исключает ложный результат и дополнительную аллергизацию.

В проведенных исследованиях показана принципиальная возможность и перспектива использования методов антигенной активации лейкоцитов in vitro и технологии проточной цитометрии при обследовании лиц, подлежащих вакцинации против бруцеллеза.

Для оценки уровня напряженности противобруцеллезного иммунитета рекомендуется применять РБТЛ с выявлением бластных форм клеток моноклональными антителами к CD34+ с последующим учетом результатов реакции с использованием проточного цитометра.

При лабораторном обследовании лиц, подлежащих вакцинации (ревакцинации) против бруцеллеза, с целью выявления повышенной чувствительности (аллергизации) организма к бруцеллезному антигену рекомендуется использовать тест активации базофилов с иммунофенотипической детекцией экспрессии маркера дегрануляции (CD63+) с помощью проточной цитометрии.


Literature



  1. Logvynenko O.V., Rakitin E.L., Ponomarenko D.G., Kostjuchenko M.V., Sarkisian N.S., Berdnikova T.V. [Features immunological parameters of blood in patients with various forms of brucellosis]. Infektsiya i immunitet 2013; 3(3): 275–278. (In Russ.)

  2. Safonov A.D. [The modern view of the clinical classification of brucellosis]. Infektsionnyie bolezni 2011; 9(2): 106–109. (In Russ.)

  3. Profilaktika brutselleza. Sanitarno-epidemiologicheskie pravila SP 3.1.7.2613-10. [Prevention of brucellosis. Sanitary rules JV 3.1.7.2613-10]. (In Russ.) http://www.epidemiolog.ru/law/san/3240081.html

  4. Profilaktika i laboratornaya diagnostika brutselleza lyudey. Metodicheskie ukazaniya MU 3.1.7.1189-03. [Prevention and laboratory diagnosis of brucellosis in humans. Guidelines MU 3.1.7.1189-03]. (In Russ.). http://www.bestpravo.ru/rossijskoje/vg-dokumenty/c5b.htm

  5. Bogachyova N.V., Darmov I.V., Elagin G.D., Kryuchkov A.V., Tikhvin O.V. [Modern laboratory methods of assessing the effectiveness of immunization against dangerous and especially dangerous infections]. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika 2011; 6: 39–42. (In Russ.)

  6. Ponomarenko D.G., Logvynenko O.V., Sarkisian N.S., Rakitin E.L., Golub O.G., Kulichenko A.N. [Allergodiagnostics new approach to brucellosis]. Infektsiya i immunitet 2013; 3(1): 89–92. (In Russ.)

  7. Frimel G., ed. Immunologicheskie metodyi [Immunological methods]. Moscow: Meditsina, 1984. 476 p. (In Russ.)

  8. Vasneva J.P., Toropova N.E. [Determination of hypersensitivity to the vaccine in children]. In: Materialyi nauchno-prakticheskoy konferentsii, posvyaschennoy 10-letiyu Omskogo diagnosticheskogo tsentra. [Proceedings of the scientific-practical conference dedicated to the 10th anniversary of the Omsk diagnostic center]. Omsk, 1998: 124–125 (In Russ.)

  9. Kravtsov A.L. [Improving the diagnosis of infectious diseases associated with using the technology of pulsed flow cytometry]. Biotehnologiya 2013; 3: 38–23 (In Russ.)

  10. Kulichenko A.N., Rakitina E.L., Ponomarenko D.G., Logvynenko O.V., Ryazanov A.G. [Using the BAT with antraksinom for laboratory (in vitro) diagnosis of anthrax]. Problemyi osobo opasnyih infektsiy 2012; 3: 86–88. (In Russ.).

  11. Zurochka V.A., Zurochka A.V., Kostolomova E.G. [Effect cells phenotype CD34+, CD45dim, defensins and various synthetic peptides of the active center of GM-CSF on RBTL in vitro]. Vestnik Uralskoy meditsinskoy akademicheskoy nauki 2012; 4: 200–201. (In Russ.)

  12. Almajid F.M. Lymphocyte activation test for diagnosis of seronegative brucellosis in humans. Indian J. Path. Microbiol. 2011; 54(4): 775–781.

  13. do Livramento A., Sampaio J., Schultz J. In vitro lymphocyte stimulation by recombinant hepatitis B surface antigen: a tool to detect the persistence of cellular immunity after vaccination. Virol. Methods 2013; 193(2): 572–578.

  14. Hermann E., Berthe A., Truyens C., Alonso-Vega C., Parrado R., Torrico F., Carlier Y., Braud V. Killer cell immunoglobulin-like receptor expression induction on neonatal CD8+ T cells in vitro and following congenital infection with Trypanosoma cruzi. Immunology 2010; 129(3): 418–426.

  15. Ponomarenko D.G., Rakitina E.L., Logvinenko O.V., Kostjuchenko M.V., Sarkisjan N.S., Kovalevich N.I. Applicazione della tecnologia di stimolazione antigenica delle cellule per la diagnosi di brucellosis. Italian Science Review 2014; 1(10): 178–181.

  16. Raue H.P., Beadling C., Haun J., Slifka M. K. Cytokine-mediated programmed proliferation of virus-specific CD8+ memory T cells. Immunity 2013; 38(1): 131–139.

  17. Bezopasnost rabotyi s mikroorganizmami I–II grupp patogennosti (opasnosti). Sanitarno-epidemiologicheskie pravila SP 1.3.3118-13. [Safety of work with microorganisms I-II pathogenicity groups (hazard). Sanitary rules JV 1.3.3118-13]. http://www.garant.ru/prod-ucts/ipo/prime/doc/70563038


About the Autors


For correspondence:
Ponomarenko Dmitry Georgievich, Cand. Biol. Sci.; Head, Laboratory for Pathomorphology of Particularly Dangerous Infectious Diseases, Stavropol Antiplague Institute, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare
Address: 13-15, Sovetskaya St., Stavropol, Stavropol Territory 355035
Telephone/fax: +7(865-2) 26-03-12
E-mail: ponomarenko.dg@gmail.com


Similar Articles


Бионика Медиа