Россия – один из крупных ареалов инфекционных заболеваний, передающихся клещами. Ежегодно к врачам различных специальностей по поводу присасывания клеща обращается несколько сотен тысяч пациентов1.
Известно, что клещи служат переносчиками целого ряда болезней человека, среди которых одним из самых распространенных (около 2000 заболеваний в год) является клещевой энцефалит (КЭ) [1], вирус которого (ВКЭ) относящийся к роду Flavivirus семейства Togaviridae, вызывает заболевание, характеризующееся лихорадкой, переходящей в потенциально смертельный энцефалит [2]. Для этого заболевания важна ранняя диагностика для своевременного назначения этиотропной терапии. Наиболее часто присасыванию клещей подвержены сельские жители, а также участники полевых экспедиций и туристы в отдаленных районах, у которых диагностика методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) не может быть оперативно выполнена. Кроме того, обследование пациентов с применением ПЦР эффективно только в период вирусемии, который при флавивирусных инфекциях не превышает 7 дней [3]. В более поздний период лабораторная диагностика основывается на выявлении серологических маркеров – специфических IgM и IgG [4]. Для ранней диагностики в условиях сельских медицинских учреждений со слабо развитой диагностической базой, куда первично поступают пациенты с присасыванием клещей, необходимы простые тесты, позволяющие быстро выявлять антитела к ВКЭ.
Ранее мы сообщали о разработке платформы автономных наборов для выявления антител методом дот-анализа [5]. Эти наборы включают комплект аналитических матриц (пластиковые подложки с иммобилизованными в виде отдельных пятен реагентами захвата) и аналитические ванны, заполненные готовыми рабочими растворами. Анализ включает последовательные инкубации подложки в исследуемом образце и рабочем растворе зонда – реагента детекции, связанного с коллоидным золотом. Не связавшиеся с подложкой компоненты после каждой инкубации удаляются отмывками, а иммобилизованное на подложке в результате иммунной реакции коллоидное золото проявляется путем каталитического восстановления на его поверхности серебра из раствора, содержащего растворимую соль серебра и восстановители [6]. Усиление окраски и дополнительная ее стабилизация могут быть достигнуты при переводе серебра в его сульфид путем обработки в щелочном растворе тиомочевины. Такие наборы позволяют в течение 60–70 мин при комнатной температуре выявлять специфические антитела в образцах сыворотки или плазмы крови, не требуют дополнительного оборудования и энергообеспечения, допускают визуальный учет результатов с несложной интерпретацией. Однако изготовление таких наборов требует тщательного подбора иммунокомпонентов для обеспечения необходимых чувствительности и специфичности анализа (мультиплексный).
Цель исследования: оценка эффективности применения рекомбинантного аналога домена III оболочечного гликопротеина Е ВКЭ (EDIII-ВКЭ) и куриных IgY-антител при разработке диагностического набора для выявления IgG к ВКЭ методом дот-анализа.
Материалы и методы
В работе использовали бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин, лимонную кислоту, метол, натрия азид, полный адъювант Фрейнда, тетрахлорзолотую кислоту (ТХЗК [HAuCl4)] и твин-20 (Sigma-Aldrich, США); натрия цитрат (Na3C6H5O7*5.5H2O), о.с.ч. («Реахим», Россия), другие отечественные реактивы с квалификацией не ниже ч. д. а. В качестве материала подложки использовали сплошной белый пластик на основе ПВХ Zenofol-print («Зенон», Новосибирск).
Иммунореагенты
В качестве аналитов в сравнительных экспериментах использовали антитела человека классов М, А и G («Имтек», Россия), а в качестве реагентов детекции – нативный белок А из Staphylococcus aureus (SpA), нативный белок G стрептококковый (SpG), моноклональные антитела мыши к IgG человека (МКАТ IgG-a/Hum; Sigma-Aldrich, США), и куриные антитела против IgG человека (IgY-a/Hum), приготовление которых описано ниже.
Исследованы:
- панель образцов, содержащих и не содержащих антитела к ВКЭ, включающая 40 положительных и 20 отрицательных сывороток крови, предоставленная БУЗ Республики Алтай «Центр по профилактике и борьбе со СПИД» и охарактеризованная с использованием коммерческого набора реагентов для иммуноферментного выявления и количественного определения иммуноглобулинов класса G к ВКЭ ВектоВКЭ-IgG (D-1156) (РУ № РЗН 2017/5605 от 04.2017 АО «Вектор-Бест»).
- панель образцов, содержащих антитела к вирусу желтой лихорадки, включающая 20 сывороток крови, полученных от сотрудников Центра, вакцинированных против желтой лихорадки перед выездом в служебные командировки в страны Африки (сотрудники подписывали информированное согласие на участие в исследовании, которое было одобрено на заседании Этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора № 4 от 14 апреля 2022 г.);
- коммерческая панель из 9 образцов, содержащих антитела к вирусу денге (Dengue Fever Verification panel, KZMC028), производства ZeptoMetrix®, LLC (США).
При проведении лабораторных исследований все пробы подвергались кодированию.
Получение куриных антител против IgG человека (IgY-a/Hum)
Кур иммунизировали внутримышечно в грудные мышцы препаратом «Иммуноглобулин человека нормальный» (НПО «Микроген», Россия) с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 в дозе 500 мкг/животное. Повторную иммунизацию проводили на 10, 22, 32, 44, 56, 68-е сутки, используя неполный адъювант Фрейнда. Яйца от иммунизированных кур собирали спустя 20 сут. после последней иммунизации и хранили при 4 °С. После отделения желтка его суспендировали в двойном объеме натрий-фосфатного буферного раствора (НФР), рН 7,3, добавляли полиэтиленгликоль-6000 (ПЭГ-6000) из расчета 3,5% от объема суспензии, перемешивали и центрифугировали при 4 °С в течение 20 мин при 4000 g. Удаляли липидную составляющую с помощью складчатого фильтра, вносили ПЭГ-6000 из расчета 8,5% на общий объем супернатанта, перемешивали и повторно центрифугировали в указанном режиме. Осадок растворяли в 10 мл НФР, добавляли 1,2 г ПЭГ-6000, перемешивали и вновь центрифугировали как указано выше. Осадок растворяли в 800 мкл НФР и проводили диализ против НФР в течение суток с двукратной сменой раствора. Полученные антитела хранили при -20 °С.
Приготовление зондов детекторных белков с коллоидным золотом
Получение золя золота (20 нм), определение дозы нагрузки золя детекторными антителами в коагуляционном тесте, стабилизацию и очистку зонда проводили по ранее описанной методике [7]. Таким образом получены зонды: Au-SpA, Au-SpG, Au-IgG-a/Hum и Au-IgY-a/Hum.
Получение EDIII-ВКЭ
Синтезировали нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент оболочного белка E ВКЭ, соответствующий домену III (EDIII-ВКЭ) штамма Glubinnoe/2004 [GenBank: DQ862460.1], и клонировали ее в составе плазмиды рЕТ32. Рекомбинантной плазмидой рЕТ32-EDIII-ВКЭ трансформировали клетки E. coli штамма Neb.stbl (New England Biolabs) методом химической трансформации. Клетки высевали на селективную среду, содержащую LB агар и 100 мкг/мл ампициллина, и использовали полученные колонии для наработки плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора QIAfilter Plasmid Midi Purification Kit (QIAGEN, США) по методике, рекомендуемой производителем. Правильность сборки генетической конструкции проверяли секвенированием по Сенгеру. Для экспрессии гена, кодирующего белок ЕDIII-ВКЭ, трансформированные плазмидой pET32-ЕDIII-ВКЭ клетки E .coli штамм BL21(DE3) культивировали в среде LB до оптической плотности (OD) 0,6–0,8. В культуру клеток вносили изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG/ИПТГ, Sigma, США) до концентрации 0,5 мМ и инкубировали в течение 16 ч при 37 °С и 180 об/мин. Биомассу осаждали центрифугированием (6000 g, 15 мин, 4 °С), ресуспендировали в буферном растворе (30 мМ NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 20 мМ имидазол, 8 M Urea, 1% TritonX100, pH 7,4) и обрабатывали ультразвуком циклами по 2 мин с частотой 100 мГц до достижения OD=0,2. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (25 000 g, 25 мин, 4 °C). Очистку целевого белка выполняли методом металл-хелатной аффинной хроматографии.
Дот-иммуноанализ
Реагент захвата (EDIII-ВКЭ) с концентрацией 2,5 мкг/мл или серии двукратных разведений аналитов в 0,01 М боратном буферном растворе (рН 6,0) аликвотами по 3 мкл дискретно наносили на поверхность подложки и высушивали 2 ч при 45 °С. Поверхность подложек блокировали погружением в раствор 0,2% казеина (2 ч при 20 °С), просушивали, упаковывали в полиэтилен и хранили при 4 °С.
Дот-анализ выполняли при комнатной температуре в многоячеечной аналитической ванне, заполненной в объеме 400 мкл готовыми к применению растворами: ячейка 1 – ФСБТ (0,02 М натрий-фосфатный буферный раствор с 0,8% NaCl, 0,1% твин-20 и 0,1% азида натрия, рН 7,2) с 0,02% казеина; ячейки 2, 3, 5 и 6 – ФСБТ; ячейка 4 – рабочее разведение соответствующего зонда в ФСБ-Т; ячейки 7, 8, 10 и 12 – очищенная вода, ячейка 9 – проявитель (0,5% лимонной кислоты, 0,2% метола и 0,2% нитрата серебра в очищенной воде); ячейка 11 – стабилизатор (1% тиомочевины и 1% гидроокиси натрия в очищенной воде). В первый ряд ячеек ванны вносили по 20 мкл исследуемых образцов, погружали подложки и инкубировали в течение 30 мин, а затем последовательно перемещали по следующим рядам ячеек с инкубациями: 30 мин в ячейке 4, 7 мин в ячейке 9 и по 1 мин в остальных ячейках. После анализа подложки подсушивали на воздухе, оцифровывали полученное изображение и учитывали оптические сигналы (в отн. ед. светопоглощения) с использованием компьютерной программы «DOTREADER 2000»2.
Все эксперименты выполняли в 5 повторах. Статистическую обработку полученных данных проводили стандартными методами (оценка среднего, стандартное отклонение, доверительный интервал (ДИ) для вероятности 95%, коэффициент вариации) с помощью программного продукта Microsoft Excel. Количественные данные представлены в виде M ± ∆х, где М – среднее значение, ∆х – полуширина ДИ для вероятности 95% (р = 0,95, α = 0,05). Отсекаемое в дот-анализе значение (ОПкрит) рассчитывали как M + ∆х для всего пула отрицательных образцов.
Результаты
Для сравнительной оценки способности наиболее популярных вторичных иммунореагентов (протеины А и G, мышиные моноклональные IgG и куриные поликлональные IgY антитела против IgG человека) реагировать с иммуноглобулинами классов A, M и G человека из анализируемых иммуноглобулинов (аналитов) готовили серии двукратных разведений и дискретно, аликвотами по 2 мкл, наносили их на подложки. Подложки обрабатывали как описано в разделе «Материалы и методы» и выполняли дот-анализ с зондами, приготовленными на основе коллоидного золота и реагентов детекции по описанной ранее технологии [7]. Положительным результатом считали отчетливо различимое визуально темное пятно в месте иммобилизации определенного аналита, а за чувствительность выявления принимали концентрацию аналита в конечном разведении, дающем положительный результат. Результаты сравнительной оценки чувствительности выявления иммуноглобулинов человека зондами на основе разных реагентов детекции представлены на рисунке.
Оценку диагностической чувствительности выявления антител к ВКЭ с использованием зондов на основе мышиных и куриных антител против IgG человека, а также способности антигена EDIII-ВКЭ дифференцировать антитела к различным флавивирусам выполняли с использованием панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к ВКЭ, предварительно охарактеризованную с использованием коммерческого набора реагентов ВектоВКЭ-IgG, а также панелей, содержащих антитела к вирусам желтой лихорадки и лихорадки денге. За положительный результат принимали значение M-∆х, превышающее ОПкрит. Результаты приведены в табл. 1.
Дополнительно чувствительность определения специфических антител зондами с мышиными и куриными антителами детекции оценивали на двух случайно выбранных положительных образцах. Готовили серии двукратных разведений образцов от 1:10 до 1:1280 и выполняли 5 параллельных анализов с каждым зондом. По результатам 5 повторов для каждого анализа вычисляли среднее значение и ДИ (M ± ∆х) для вероятности 95%. За положительный результат принимали значение M-∆х, превышающее ОПкрит. (табл. 2).
Обсуждение
В качестве реагентов детекции в серологических методах обычно используют вторичные антитела – антитела против иммуноглобулинов человека, а также протеины А и G микробиологического происхождения, способные связываться с константной частью (Fc-фрагментом) антител. В последнее время интерес ученых вызывает применение в анализе антител, выделяемых из яиц иммунизированных кур – так называемые IgY-антитела, которые можно получать в больших количествах и с высокими показателями активности и специфичности [8, 9]. Специфичность реагента детекции определяется возможностью его связывания напрямую с реагентом захвата или, при выявлении отдельных классов иммуноглобулинов, избирательностью реакции с ними. В то же время специфичность и аффинность детекторного белка в значительной степени сказываются на чувствительности анализа, а его свойства и чистота – на эффективности связывания с выбранной меткой, что также влияет на чувствительность определения [7]. Куриные IgY-антитела значительно отличаются от IgG по структуре, молекулярной массе и ряду физико-химических свойств [10], что может повлиять на эффективность их связывания с частицами золя.
При оценке чувствительности выявления разных классов иммуноглобулинов человека в дот-иммуноанализе с использованием зондов на основе разных реагентов детекции (см. рисунок) видно, что все использованные зонды выявляют IgG человека в концентрации до 6 мг/мл. Известно, что динамический диапазон концентраций специфических антител, к которому приводит естественный иммунный ответ на инфекцию, составляет от 10 нг/мл [11] до более 3 мкг/мл [12]. Таким образом, все использованные зонды способны выявлять нижний порог естественного иммунного ответа. Зонды с мышиными IgG-a/Hum и куриными IgY-a/Hum выявляют IgG, но не реагируют с IgМ и IgА человека, тогда как зонды с протеинами А и G взаимодействуют с иммуноглобулинами классов М и А человека, что согласуется с ранее опубликованными данными [13]. Приведенные на рисунке результаты являются сравнительными данными и не служат показателями лимита определения, поскольку на эту характеристику могут влиять такие факторы, как эффективность адсорбции аналитов на подложке, точность определения их исходной концентрации, сроки и условия хранения и др., которые сложно учесть при исследовании коммерческих препаратов.
На следующем этапе проводили сравнительную оценку зондов на основе моноклональных мышиных IgG-a/Hum и куриных IgY-a/Hum (как реагентов детекции избирательно выявляющих иммуноглобулины класса G) при определении в образцах сыворотки человека IgG к ВКЭ. Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что оба зонда адекватно определяют образцы панели, содержащие и не содержащие антитела к ВКЭ (диагностическая чувствительность и специфичность определения образцов панели 100%).
Проблемой серологической диагностики КЭ является выраженная реактивность с антителами к другим флавивирусам, поскольку аминокислотная гомология белков, кодируемых геномами разных видов флавивирусов, достигает 70–90% [3, 4, 14]. Для того чтобы преодолеть перекрестную реактивность в серодиагностике флавивирусов предпочтительно использовать не цельный вирус, а рекомбинантные антигены [15, 16]. В качестве реагента захвата в наших экспериментах использовали рекомбинантный аналог EDIII-ВКЭ, содержащий наибольшее число видоспецифичных эпитопов [17, 18] и оценивали его способность дифференцировать антитела к ВКЭ от антител к вирусам желтой лихорадки и денге в соответствующих панелях сывороток. Данные табл. 1 демонстрируют отсутствие взаимодействия с образцами гетерогенных панелей, что подтверждает выводы других исследователей [18–20] о высокой специфичности использованного реагента захвата.
Данные экспериментов по сравнительной оценке чувствительности выявления использованными зондами специфических антител в отдельных образцах (см. табл. 2) показывают, что зонды на основе поликлональных IgY-a/Hum позволяют фиксировать положительный результат в большем на 1 титр разведении, и обеспечивают на 10–20% более интенсивный оптический сигнал по сравнению с зондами на основе мышиных моноклональных IgG-а/Hum. Эти результаты согласуются с представлениями о большей чувствительности поликлональных антител по сравнению с моноклональными, поскольку последние способны выявлять только часть специфических антител, ограниченную избирательностью реагента, однако для подтверждения статистической значимости выявленных различий необходимы более масштабные эксперименты.
Заключение
Проведенные исследования позволяют сделать вывод о перспективности применения рекомбинантного аналога EDIII-ВКЭ при изготовлении диагностических наборов для дот-анализа антител к ВКЭ. Наборы, изготовленные с использованием этого реагента захвата, обладают высокой чувствительностью и способны обеспечить дифференцирование антител к ВКЭ от антител к другим флавивирусам. Полученные данные, наряду с известными соображениями о технологических, эксплуатационных и экономических и этических преимуществах куриных антител перед антителами млекопитающих [8–10], позволяют рассматривать зонды на основе IgY-a/Hum, в качестве перспективных реагентов для анализа антител. Изготовленные с использованием этих компонентов наборы для дот-анализа антител к ВКЭ обладают высокой чувствительностью и специфичностью, полностью укомплектованы, не требуют энергообеспечения и могут найти применение для диагностики КЭ в отдаленных районах с недостаточно развитой инфраструктурой.
