Сегодня в области диагностики гепатитов В и С in vitro существует большое разнообразие наборов реагентов для качественного и количественного определения вируса. В номенклатурной классификации медицинских изделий (МИ) с последними изменениями, утвержденными Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 25 сентября 2014 г. № 557н, МИ для диагностики in vitro делятся на [1, 2]:

1. Анализаторы для диагностики in vitro.
2. Емкости/контейнеры для проб для диагностики in vitro.
3. Программное обеспечение для диагностики in vitro.
4. Реагенты/наборы для определения аналитов для диагностики in vitro.
5. Реагенты/оборудование/расходные материалы общелабораторные для диагностики in vitro.
6. Среды питательные для диагностики in vitro.

Данный обзор посвящен различным требованиям и регламентам, принятым в Российской Федерации и за рубежом, в основном п. 4 вышеуказанного списка, и в первую очередь реагентам/наборам для диагностики вирусов гепатитов В (ВГВ) и С (ВГС) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.

В нашей стране регламентирующими документами, посвященными разработке и регистрации МИ, следовательно, актуальными и для ПЦР-диагностики in vitro, являются: постановления Правительства Российской Федерации [3, 4], приказы Минздрава России [1, 2, 5], ГОСТы [6–10]; в ЕС: Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. [11], European Pharmacopoeia [12], CTS IVD – Common technical specifications for in vitro diagnostic medical devices [13].

Часть ГОСТов РФ представляют собой адаптивные переводы соответствующих европейских или международных стандартов и вместе с постановлениями Правительства и приказами Минздрава России являются общими документами для всех МИ для диагностики in vitro. В то же время упомянутые документы ЕС содержат разделы, посвященные специально МИ на основе методов амплификации нуклеиновых кислот. Эти методы обладают рядом особенностей, о которых речь пойдет далее. Среди российских ГОСТов, относящихся именно к ПЦР-диагностике, сейчас действует несколько документов, стандартизирующих тестирование пищевых продуктов и кормов для животных, а также лекарственных средств для ветеринарии [14–18]:

• ГОСТ Р 52833-2007 «Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Общие требования и определения»;
• ГОСТ ISO 22119-2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Общие требования и определения»;
• ГОСТ ISO 22118-2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения и количественного учета патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Технические характеристики»;
• ГОСТ ISO 20837-2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Требования к подготовке образцов для качественного обнаружения»;
• ГОСТ Р 56140-2014 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Выявление ДНК микроорганизмов рода Mycoplasma методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)» (дата введения – 01.01.2016).

Для ПЦР-диагностики ВГВ или ВГС на момент написания данного обзора ГОСТов не найдено. ПЦР как метод имеет гораздо более широкие возможности применения, поэтому существующих ГОСТов явно недостаточно для стандартизации МИ на основе метода ПЦР в более широком применении.

По сравнению с другими методами диагностики in vitro ПЦР является высокочувствительным методом детекции, поэтому в европейских и российских регламентирующих документах к анализу с помощью ПЦР предъявляется ряд особых требований для снижения риска контаминации [12]:

• транспортировку и хранение образцов нужно проводить в условиях, предотвращающих их контаминацию целевой последовательностью извне, дегратдацию нуклеиновой кислоты, а также ингибирование ПЦР;
• предотвращение контаминации в процессе проведения анализа. Для этого анализ разбивают на этапы и делят пространство, в котором проводится анализ, на зоны:
  • зона подготовки ПЦР-смеси (зона, в которой готовят реагенты, не контактировавшие с целевой последовательностью, например, праймеры, буферы, ферменты и т. д.);
  • зона пре-ПЦР (зона подготовки реагентов, образцов и контролей к ПЦР);
  • зона ПЦР (амплификация целевой последовательности в закрытой системе);
  • зона пост-ПЦР детекции (необходима только для систем с детекцией ампликонов отдельно от амплификации, например, электрофорезом).

Следует отметить, что данные требования в большей степени относятся к организации работы лабораторий, которую отдельно регламентирует ГОСТ Р ИСО 15189-2009 (идентичен международному стандарту ISO 15189:2007) [19].

Кроме снижения риска контаминации в европейских стандартах прописаны следующие требования к МИ на основе ПЦР [12]:

• наличие внутреннего контрольного образца (ВКО). Он должен амплифицироваться со схожей эффективностью, что и целевая последовательность, представлять тот же тип нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК), что и целевая последовательность. ВКО необходимо добавлять в исследуемые образцы перед этапом выделения нуклеиновой кислоты. Таким образом, ВКО выполняет роль контроля всех этапов ПЦР-анализа: экстракции, обратной транскрипции, амплификации, детекции;
• наличие внешних контролей:
  • положительный контрольный образец (ПКО), содержащий определенное число копий целевой последовательности (в случае количественных тест-систем концентрация этого контроля обязательно должна быть охарактеризована в измеряемых единицах);
  • отрицательный контрольный образец (ОКО) – образец аналогичного с исследуемыми образцами состава и с подтвержденным отсутствием целевой последовательности;
• калибровка системы должна проводиться производителем с использованием международных стандартных образцов.

При разработке и последующей регистрации МИ необходимо учитывать разделение инфекционных агентов по степени риска на классы, к которым предъявляются разные требования к экспертизе и проверке изделий.

В соответствии с Директивой 98/79/ЕС [10]:

• список А – изделия для определения групп крови [система AB0, резус (C, c, D, E, e) анти-Kell], маркеров ВИЧ-1 и -2, HTLV I и II, а также гепатитов B, C и D;
• список B – другие изделия, например, для определения цитомегаловируса, хламидий.

В соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 6 июня 2012 г. № 4н [1]:

• класс 1 – МИ с низкой степенью риска;
• класс 2а – МИ со средней степенью риска;
• класс 2б – МИ с повышенной степенью риска. МИ относятся к классу 2б, если они предназначаются для следующих целей:
  • выявление инфекционных агентов заболеваний, передающихся половым путем;
  • выявление присутствия инфекционных агентов, когда есть существенный риск того, что ошибочный результат может быть причиной смерти или потери дееспособности обследуемого пациента или плода;
  • определение статуса инфекционной болезни или иммунного статуса при наличии риска того, что ошибочный результат будет приводить к терапевтическому решению, вызывающему неизбежную опасность для жизни пациента;
  • скрининг для выбора пациентов для избирательной терапии или для диагностики (например, диагнос­тики онкологических заболеваний);
  • генетическое тестирование, когда результат теста ведет к серьезному вмешательству в жизнь человека;
  • лечение пациентов, страдающих угрожающей жизни инфекционной болезнью;
  • скрининг врожденных болезней плода;
• класс 3 – МИ с высокой степенью риска. К классу 3 относятся МИ, предназначенные для выявления инфекционных агентов в крови, компонентах крови, производных крови, клетках, тканях или органах, с целью оценки возможности их переливания или трансплантации; МИ, предназначенные для выявления инфекционных агентов, которые могут стать причиной болезней, угрожающих жизни человека, с высоким риском распространения и которые обеспечивают решающую информацию для постановки правильного диагноза.

При этом, в соответствии с ГОСТом 31508-2012, наборы реагентов могут быть отнесены к классам 2а, 2б или 3 в зависимости от потенциального риска, но, используя данный ГОСТ, весьма затруднительно однозначно определить класс опасности реагентов для ПЦР-диагностики in vitro, отсутствующий в приложении Б (ориентировочная классификация МИ по степени риска) [5].

Разработка МИ на основе ПЦР включает этапы оценки и валидации основных характеристик изделия. В клинической лабораторной диагностике ключевыми характеристиками МИ для качественного обнаружения генетического материала инфекционного агента являются [12, 13, 19–21]:

• аналитическая специфичность – способность данного метода выявлять исключительно целевой маркер;
• аналитическая чувствительность (предел детекции) – наименьшая концентрация нуклеиновой кислоты в образце, которая обнаруживается данным методом в 95% случаев [12]. Для количественных тестов под аналитической чувствительностью могут подразумевать отношение изменения показания измерительной системы к соответствующему изменению измеряемой величины [19];
• диагностическая специфичность – способность данного МИ распознавать отсутствие целевого маркера, сочетающегося с конкретной болезнью или состоянием. Определяется как процент отрицательных результатов анализа проб, для которых установлено отсутствие целевого маркера;
• диагностическая чувствительность – способность данного МИ идентифицировать присутствие целевого маркера, сочетающегося с конкретной болезнью или состоянием. Определяется как процент положительных результатов анализа проб субъектов, для которых конкретная болезнь или состояние установлены;
• коэффициент сбоя системы – частота сбоев всего анализа, когда весь процесс проводится в соответствие с инструкцией производителя на 100 образцах с концентрацией, равной 3-кратной аналитической чувствительности (пределу детекции) [13].

МИ для количественного обнаружения нуклеиновой кислоты инфекционного агента в дополнение к вышеуказанным характеристикам должны сопровождаться следующими [12, 21]:

• точность – степень близости результата к принятому опорному значению;
• прецизионность (сходимость) – степень близости друг к другу независимых результатов измерений;
• повторяемость – сходимость независимых результатов измерений, полученных одним и тем же методом на идентичных объектах испытаний, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в пределах короткого промежутка времени;
• воспроизводимость – сходимость независимых результатов измерений, полученных одним и тем же методом, на идентичных объектах испытаний, в разных лабораториях, разными операторами, с использованием различного оборудования;
• линейный диапазон – диапазон концентраций целевого маркера, в котором наблюдается линейная зависимость между измеряемым сигналом и концентрацией целевой последовательности.

Очень важным отличием регламентирующих документов ЕС является наличие более полной информации о видах и объемах экспериментов, необходимых для валидации ключевых характеристик МИ для ПЦР-диагностики. Ниже представлены эти требования в соответствии с CTS IVD (лишь часть их встречается в российских ГОСТах) [13]:

• диагностическая специфичность – определяется по результатам тестирования 500 (для качественных) или 100 (для количественных) отрицательных образцов;
• предел детекции – определяется по результатам пробит-анализа серии разведений контрольного образца до предельных значений. Статистический анализ проводится по результатам анализа не менее 7 разведений (не менее 24 повторов каждого) с различной концентрацией ДНК/РНК, близкой к предельной, после чего предел детекции определяется как пороговое значение концентрации с вероятностью обнаружения 95%;
• линейный диапазон – определяется по серии разведений контрольного образца с шагом 0,5 lg или менее, серия разведений должна состоять из не менее 12 концентраций по 10 повторов каждой;
• точность, сходимость, повторяемость и воспроизводимость – оцениваются по результатам 10 независимых постановок. Каждая постановка должна содержать 5 разных разведений по 5 повторов каждого;
• уровень сбоя системы – определяется по итогам тестирования 100 образцов с концентрацией, равной 3-кратному пределу детекции; допускается не более 1 отрицательного результата из 100;
• отсутствие кросс-контаминации – подтверждается в 5 независимых постановках по 20 образцов (10 положительных и 10 отрицательных в шахматном или зашифрованном порядке);
• различные генотипы возбудителя тестируются на не менее 10 образцах для каждого генотипа (чем больше, тем лучше). В качестве образцов необходимо использовать стандартизованные панели образцов (в случае отсутствия панелей могут быть использованы генетические конструкты, например, ДНК-плазмиды, РНК-транскрипты или РНК-фаги).

Все результаты технических и клинических испытаний подаются в виде отчета в нотифицированный орган, который определяет полноту и правильность подготовленного отчета, а также способен провести собственную проверку заявленных характеристик изделия. В соответствии с Постановлением Правительства Российской Федерации от 27 декабря 2012 г. № 1416, во время регистрации МИ экспертным учреждением осуществляется экспертиза полноты и результатов проведенных технических испытаний и клинических испытаний (правда, требуемый минимальный объем нигде не регламентирован, но в п.12 Приказа Минздрава России от 09.01.2014 № 2н говорится, что программа технических и клинических испытаний составляется совместно с заявителем и утверждается испытательной организацией).

В соответствии с приложением IX Директивы 98/79/ЕС [11] по медицинским средствам диагностики in vitro, нотифицированный орган должен соответствовать следующими критериям:

1. Нотифицированный орган, его руководитель и персонал, ответственный за оценку и проверку, не должны быть ни разработчиками, ни производителями, ни поставщиками, ни монтажниками, ни пользователями изделий, которые они контролируют, ни уполномоченными представителями любой из перечисленных сторон. Они не могут непосредственно привлекаться к разработке, конструированию, продажам или обслуживанию этих изделий, не могут представлять стороны, заинтересованные в этих работах. Это не должно исключать возможности обмена технической информацией между изготовителем и этим органом.
2. Нотифицированный орган и его персонал должны выполнять работы по оценке и проверке с самой высокой степенью профессиональной честности и технической компетенции в области МИ; они должны быть независимы от любого давления и стимулов, в частности, финансовых, которые могут повлиять на их суждение или результаты инспекции, особенно со стороны лиц или групп лиц, заинтересованных в результатах проверки.
3. Нотифицированный орган должен быть способен выполнить все задачи, установленные для таких органов одним из Приложений III–VII Директивы, для которых он был нотифицирован; эти задачи могут выполняться самим органом или под его ответственность. В частности, он должен иметь в своем распоряжении необходимый персонал и необходимые средства, которые дают ему возможность выполнять надлежащим образом технические и административные задачи, связанные с оценкой и проверкой. Это включает наличие в организации достаточного научного персонала, обладающего адекватным опытом и знаниями, необходимыми для оценки биологических и медицинских функциональных возможностей и рабочих характеристик изделий, для которых оно назначается. Нотифицированный орган также должен иметь доступ к оборудованию, необходимому для требуемых проверок.
4. Персонал, осуществляющий проверку должен иметь:
   • основательную профессиональную подготовку по всем работам по оценке и проверке, для которых этот орган назначается;
   • удовлетворительное знание правил инспекций, которые он выполняет, и достаточный опыт таких инспекций;
   • способность, необходимую для составления сертификатов, документов и отчетов, требуемых для доказательства того, что эти инспекции проведены.
5. Объективность инспекционного персонала должна быть гарантирована. Его оплата не должна зависеть ни от количества проведенных инспекций, ни от их результатов.

В России таким органом является Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения, а применитально к МИ для диагностики in vitro – ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» (ВНИИИМТ) Вместе с тем, этот институт позиционируется в том числе и разработчиком новых МИ, новых медицинских технологий и методов лечения, что не удовлетворяет первому критерию Директивы 98/79/ЕС для нотифицированного органа [11]. Правда, на момент написания обзора поиск по запросам «ВНИИИМТ» или «Институт медицинской техники» в Государственном реестре медицинских изделий и организаций (индивидуальных предпринимателей), осуществляющих производство и изготовление медицинских изделий (http://roszdravnadzor.ru/services/misearch/) не дал результатов ни для организации-заявителя МИ, ни для организации-производителя (изготовителя) МИ [22], то есть на данный момент ВНИИИМТ не является ни разработчиком, ни производителем зарегистрированных МИ.

Полный порядок регистрации МИ в РФ подробно определен Постановлением Правительства РФ от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий (с изменениями на 17 июля 2014 года)» [2] и Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 09.01.2014 № 2н «Об утверждении Порядка проведения оценки соответствия медицинских изделий в форме технических испытаний, токсикологических исследований, клинических испытаний в целях государственной регистрации медицинских изделий» [4].

В заключение стоит сказать, что разработка и регистрация МИ для диагностики in vitro в общем и целом регламентирована в России достаточно хорошо. Но, для МИ, основанных на методе ПЦР, в российских стандартах и регламентах не отражен весь спектр специализированных требований, имеющихся в европейских нормативных документах, например:

• необходимые для валидации ключевые характеристики МИ;
• более подробные характеристики контрольных образцов, в том числе ВКО;
• минимальные объемы экспериментов, подтверждающих аналитические характеристики МИ.

Характеристика контролей в ПЦР-диагностике очень важна, поскольку без нее невозможно адекватно интерпретировать результаты анализа. Например, если исследуемый маркер является РНК, то ПКО также должен быть рибонуклеиновой природы, то же самое и для ДНК. Тип нуклеиновой кислоты ВКО должен определяться по аналогии с ПКО. Если эти требования не предъявляются, то контрольные образцы не выполняют свою функцию контроля должным образом, и валидность результатов такого анализа остается под сомнением.

Отсутствие требований к объему экспериментов по подтверждению ключевых заявляемых характеристик МИ приводит к тому, что нет единообразия между производителями/разработчиками МИ, в результате каждое МИ проходит валидацию в соответствии с собственным видением производителя/разработчика и регистрирующего органа (эксперта, проводящего проверку документов).

Таким образом, российские производители наборов реагентов для ПЦР-диагностики инфекций с высоким уровнем социальной значимости, таких как ВГВ и ВГС, на сегодняшний день не имеют специализированных государственных стандартов и при разработке МИ могут опираться лишь на более общие стандарты для МИ для диагностики in vitro. Для более качественной разработки дополнительно необходимо опираться на международные или европейские стандарты.