Симбиотическая микрофлора толстой кишки стала традиционным предметом научных исследований, что не удивительно, принимая во внимание, с одной стороны, ее большое значение для организма хозяина, а с другой – ее малую изученность несмотря на более чем столетний период исследования. Она имеет важное общебиологическое значение для организма хозяина на протяжении всей его жизни, определяя ряд важных параметров (физиологических, биохимических, иммунологических) и служит чувствительным индикатором здоровья. Известна также ее роль как источника условно-патогенных микроорганизмов, вовлекаемых в гнойно-воспалительные заболевания человека. В мегаполисах, подобных Москве, население подвержено постоянно возрастающему воздействию вредных факторов окружающей среды (например, выхлопных газов автомобилей), что может приводить к нарушению нормального экологического баланса в организменных микробиоценозах и снижению колонизационной резистентности слизистых оболочек и кожи. Это, в частности, проявляется в распространении среди населения больших городов дисбиотических состояний микрофлоры желудочно-кишечного тракта, которые в ряде случаев характеризуются длительным упорным течением с переходом в хроническую форму и трудно поддаются коррекции [1, 2]. Особенно страдают дети младшего возраста, нормальные микробные экосистемы которых чрезвычайно лабильны и легко разрушаются под влиянием агрессивной среды.

Проведенные нами ранее исследования состояния микрофлоры толстой кишки у 13 187 жителей Москвы разных возрастных групп выявили широкое распространение дисбиоза, который характеризовался снижением или повышением показателей основных групп нормальных микробов-симбионтов, а также частым повышением показателей для условно патогенных микроорганизмов [3]. Наиболее пораженной группой оказались дети до 2 лет. У них значительно чаще выявляли высокие уровни колонизации толстой кишки S. aureus и условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ). Дефицит бифидобактерий в толстой кишке часто совпадал с более редким выделением лактобацилл и, напротив, с увеличением частоты изоляции энтерококков. В отличие от расхожего представления о ведущей роли бифидобактерий в защите от колонизации кишечника любыми условно-патогенными микроорганизмами мы не выявили ее существенного влияния на другие УПЭ. Нормальный уровень бифидобактерий также не контролировал частоту колонизации кишечника детей S. aureus.

Принимая во внимание результаты первого этапа работы, мы провели широкое исследование микрофлоры толстой кишки у ограниченного числа пациентов-детей до 2 лет с целью выявления видов микроорганизмов, которые могли бы дать дополнительную информацию о состоянии кишечного биоценоза. Поиск в основном был нацелен на выявление экологических доминант, которые, согласно существующим представлениям, играют решающую роль в поддержании равновесия в экосистемах, в данном случае в экосистеме толстой кишки. Проведенные нами ранее исследования касались лишь ограниченного числа видов анаэробных бактерий толстой кишки. В предлагаемой работе мы приводим данные по более широкому спектру факультативно анаэробных и анаэробных бактерий, которые смогли выделить и идентифицировать у обследованных детей. Изучили также связь гемолитической активности кишечных палочек, которым традиционно приписывается роль в патогенезе дисбактериоза, с присутствием у них генов, детерминирующих принадлежность к диарогенным вариантам.

Материалы и методы

Исследовали пробы фекалий у детей до 2 лет, проживающих в различных районах Москвы, по мере их обращения в лечебные учреждения, что обеспечивало метод случайной выборки. Клинический материал поступал от детей без инфекционной патологии, в основном с незначительными кишечными дисфункциями. У небольшой части детей были отмечены признаки аллергопатологии, в том числе атопических дерматитов. Всего было обследовано 219 пациентов.

Фекалии для исследования доставляли в лабораторию в специальных контейнерах, отвешивали 0,5 г материала и эмульгировали в солевом буфере с редуцирующими компонентами. После этого готовили ряд последовательных десятикратных разведений материала на том же буфере и засевали на чашки Петри с питательными средам. Для выделения микроорганизмов использовали следующий набор питательных сред: агар Эндо и Плоскирева для семейства кишечных бактерий, желточно-солевой агар для стафилококков, энтерококковый агар для энтерококков, среду МРС с сорбиновой кислотой для лактобацилл, Бифидум-среду для бифидобактерий, 5% кровяной агар для выделения стрептококков, клостридий, а также для других видов микроорганизмов, нуждающихся для своего роста в крови или гемолизирующих ее, и среду Шедлера для выделения основной группы анаэробных бактерий. Для культивирования анаэробных видов применяли специальные системы типа ГазПак производства фирм «Oxoid», «BBL» и «bioMerieux», работающие на принципе химической адсорбции кислорода. Для повышения эффективности выделения клостридий использовали этаноловый шок [4]. Посев клинического материала на питательные среды и учет результатов проводили по капельной методике в нашей модификации [5]. Идентификацию выделенных штаммов бактерий осуществляли традиционными методами, при необходимости использовали идентификационные системы API 20E и API Staph («bioMerieux»), а также системы Cristal фирмы «BBL». После определения вида микроорганизма производили пересчет количества его колоний на 1 г фекалий и полученные результаты выражали числом колониеобразующих единиц на грамм испражнений (КОЕ/г). Статистическую обработку результатов исследований проводили путем подсчета долевого показателя в процентах, его ошибки (m) и достоверности разности показателей (t).

Для определения наличия факторов вирулентности, характерных для диарогенных Escherichia coli у выделенных изолятов Escherichia coli, был выбран метод ПЦР. Экстракцию ДНК проводили с использованием комплекта реагентов «РИБО-преп» (Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва). Выявление генов вирулентности выделенных изолятов Escherichia coli проводили с использованием набора реагентов на основе метода мультиплексной ПЦР с детекцией флуоресцентного сигнала в режиме реального времени и по конечной точке («АмплиСенс® Эшерихиозы-FL»). Детекцию и дифференциацию 5 групп диарогенных эшерихий проводили по следующим генам-мишеням: ген eae, кодирующий интимин, для детекции энтеропатогенных E. coli (EPEC); гены шигоподобных токсинов stx1, stx2 и интимина eae – для энтерогеморрагических E. coli (EHEC); транскрипционный активатор экспрессии фимбрий аггрегативной адгезии aggR – для энтероаггрегативных E. сoli (EAgEC); ген термолабильного токсина (LT) – для энтеротоксигенных E. coli (ETEC); ген инвазионного плазмидного антигена ipaH – для энтероинвазивных E. coli и шигелл (EIEC and Shigella spp.) [6–8].

Результаты и обсуждение

Выделенные микроорганизмы состояли из 2 больших групп: факультативных анаэробов и строго анаэробных видов (табл.1). Все микроорганизмы в таблице представлены по убывающей частоте встречаемости. Среди факультативных анаэробов преобладали представители рода Escherichia (98,6%), Enterococcus (94,0%), Staphylococcus (56,2%), Klebsiella (45,7%), приблизительно пятую часть по частоте выделения составляли роды Enterobacter, Citrobacter и дрожжеподобные грибы. Эти микроорганизмы изолировали с частотой 23,3 21,0 и 22,8% соответственно. Представителей рода Proteus выделяли в 9,1% случаев. Частота выделения остальных факультативных видов не превышала 1%.

Таблица 1.

Анаэробные бактерии были представлены 5 доминирующими по частоте встречаемости родами: Bifidobacterium(85,4%), Clostridium(69,9%), Lactobacillus(44,8%), Bacteroides(20,6%) и Veillonella(20,1%). Следует отметить, что лактобациллы содержали не только штаммы с анаэробным метаболизмом, но и факультативно анаэробные варианты. Удалось идентифицировать 12 видов рода Clostridium, 11 видов рода Bacteroides и только 3 вида лактобацилл. К сожалению, минисистемы, которые мы использовали, предназначены только для микроорганизмов, имеющих медицинское значение, и не охватывают весь спектр кишечных микробов, а специальных систем для экологических исследований не существует.

Частота выделения других родов анаэробных бактерий не превышала 10,5%. Часть анаэробных видов не были идентифицированы по упомянутой выше причине и характеризовались только по морфологии и тинкториальным свойствам (грамположительные и грамотрицательные палочки и кокки).

Пока трудно четко определить доминирующие микроорганизмы, принимая во внимание также существование некультивируемых видов кишечных микроорганизмов. Исследования по изучению кишечной микрофлоры планируется продолжить.

На следующем этапе мы проанализировали состояние кишечной микрофлоры у обследованных детей, как это делается при выявлении дисбактериоза. Как видно из табл. 2, у большинства пациентов отмечались сдвиги в состоянии симбиотической микрофлоры. Чаще всего выявляли превышение (>107 КОЕ/г) количества негемолитических энтерококков (78,1% случаев), лактозопозитивных (>109 КОЕ/г) и гемолитических (>0 КОЕ/г) E.coli (66,7 и 36,5% соответственно), присутствие S. aureus (52,5% случаев при норме 0) и повышенные (>105 КОЕ/ г) количества УПЭ (43,4%). У 21,6% детей отмечали снижение количества бифидобактерий (<109 КОЕ/г) и у 54,3% – количества лактобацилл (<106 КОЕ/ г).

Таблица 2.

Важная роль в поддержании стабильного микробного пейзажа толстой кишки отводится бифидофлоре, лактофлоре, а также, по мнению отдельных исследователей, бактероидам [9]. Количественные параметры упомянутых микроорганизмов служат для характеристики состояния благополучия и невосприимчивости организма к инфекции, особенно у детей. В связи с этим представляло интерес сопоставление 2 наиболее контрастных групп обследованных – с нормальным и сниженным уровнем этих микроорганизмов – и изучение влияния этого фактора на состояние остальной микрофлоры.

При анализе полученных результатов было выявлено, что при сниженном (<109 КОЕ/г) уровне бифидобактерий достоверно (t>2) увеличивается частота выявления случаев со сниженным (<107 КОЕ/г) количеством лактозоположительных E. coli и, наоборот, при нормальном (>109 КОЕ/г) уровне бифидобактерий увеличивается частота выявления случаев с количеством лактозоположительных E . с oli, превышающим 107 КОЕ/г. Аналогичная картина наблюдалось и при сопоставлении частоты выделения дрожжеподобных грибов у пациентов со сниженным и нормальным числом бифидобактерий: у детей с нормальным числом бифидобактерий был достоверно выше (t >2) процент случаев с повышенным (>104 КОЕ/г) количеством грибов. В свою очередь, среди детей с нормальным числом лактобацилл (>106 КОЕ/г) чаще встречались лица с повышенным уровнем УПЭ (>105 КОЕ/г) и негемолитических энтерококков (>107 КОЕ/г). При оценке состояния кишечной микрофлоры некоторые специалисты принимают во внимание концентрацию в фекалиях бактероидов. При анализе результатов было обнаружено, что среди детей с содержанием бактероидов в фекалиях >107 КОЕ/г достоверно чаще обнаруживаются лица с концентрацией дрожжеподобных грибов выше нормы (>104 КОЕ/г). Для всех остальных сопоставлений достоверных различий не выявили.

Как уже отмечалось, среди факультативно анаэробных видов по частоте выделения преобладали кишечные палочки. Количественные и качественные характеристики этих микроорганизмов традиционно используют при выявлении дисбактериозов. Одним из свойств, которое рассматривается как неблагоприятный признак, является гемолитическая активность E. Coli и неспособность расщеплять лактозу. В этой связи для нас представляло интерес определение наличия генов факторов вирулентности, характерных для группы диарогенных эшерихий, у различных кишечных палочек, выделяемых у детей при дисбактериозе. С этой целью 149 изолятов E. coli от 126 детей были исследованы с помощью набора реагентов «АмплиСенсR Эшерихиозы-FL», предназначенного для выявления и дифференцировки 5 групп диарогенных эшерихий (EHEC, ETEC, EIEC, EAggEC, EPEC). От каждого пациента выделяли колонии биоваров lac+, lac- или hem+, или только lac+ и hem+ в зависимости от их наличия.

Лактозоположительные штаммы кишечной палочки, выделенные от тех же пациентов наряду с гемолитическими или лактозонегативными, использовали в качестве контроля. Всего было исследовано 45 гемолитических, 42 лактозонегативных и 62 лактозоположительных штаммов. В результате оказалось, что всего 8 штаммов принадлежали к диарогенным, из них 3 лактозоположительных, 3 гемолитических и 2 лактозоотрицательных. По предварительным результатам, у изученных штаммов E. coli не прослеживается зависимость между гемолитической активностью или способностью расщеплять лактозу и присутствием у них генов, детерминирующих принадлежность к диарогенным группам.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить широкий диапазон микроорганизмов, обитающих в толстой кишке у детей до 2 лет с небольшими кишечными дисфункциями. Отмечены сдвиги в состоянии кишечной микрофлоры у большинства обследованных пациентов. На первый взгляд кажется странным, что такие представители нормальной кишечной флоры, как бифидобактерии и лактобациллы не контролируют размножение в кишечнике представителей транзиторной микрофлоры или популяционные уровни УПЭ, стафилококков и энтерококков. Однако учитывая тот факт, что обследованные дети были в возрасте до 2 лет, когда еще не закончилось формирование нормальной симбиотической микрофлоры кишечника, а также состояние их здоровья, становится понятно, почему мы не наблюдали у них тех взаимоотношений между облигатными и транзиторными симбионтами, которые характерны для здорового взрослого организма. Очевидно, что в данном случае мы наблюдаем влияние внешней среды, то есть организма нездорового ребенка, на его симбиотическую микрофлору, что проявляется не только в изменении концентрации кишечных микроорганизмов, но и в характере их взаимоотношений. Неожиданным стало также отсутствие корреляции между способностью кишечных палочек гемолизировать эритроциты барана, расщеплять лактозу и принадлежностью к диарогенным E. coli.

Выводы

1. Микрофлора толстой кишки у детей до 2 лет с умеренными дисфункциями кишечника представлена широким диапазоном различных микроорганизмов с анаэробным и факультативным метаболизмом.

2. У большинства детей выявлены различные нарушения состояния симбиотической микрофлоры толстой кишки.

3. Выявлены атипичные корреляции между облигатными и транзиторными симбионтами толстой кишки.

4. Не было установлено связи между свойством кишечных палочек гемолизировать эритроциты крови барана, способностью расщеплять лактозу и принадлежностью к диарогенным группами E. coli.