Особенности распространения штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем, с различными аллельными вариантами гена, кодирующего промоторную область коклюшного токсина (ptxP)


Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашинникова Г.А., Захарова Н.С., Мерцалова Н.У., Зайцев Е.М., Салова Н.Я., Абасова Ф.М.,Требунских И.П., Скачкова В.Г., Панферова Р.А., Алексеева Л.А., Якунина О.Ю., Наретя Н.Д., van Gent M., Mooi F., Алешкин В.А.

ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора; Netherlands centre for infectious diseases control, National institute for public health and the environment, Bilthoven, Netherlands; НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, Москва; ФБУЗ Центр госсанэпиднадзора в Москве; Филиал ФБУЗ Центр госсанэпиднадзора в Москве в СЗАО; ФБУЗ Центр госсанэпиднадзора во Владимирской области, Владимир; ФБУЗ Центр госсанэпиднадзора в Новосибирской области, Новосибирск; ТО Управление Роспотребнадзора по Московской области в Дзержинске, Лыткарино, Люберецком районе
Проведен анализ особенностей структуры регуляторного ptxP гена у штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России в настоящее время. Объектами исследования служили 117 штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в Москве, Московской, Новосибирской и Владимирской областях в 2000–2010 гг., а также штаммы, выделенные в 1948–1999 гг. (из коллекции ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора). Исследование проводили путем секвенирования фрагментов гена ptxР с последующим анализом нуклеотидных последовательностей с помощью геномной и программной базы BLAST и базы данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). Охарактеризованные штаммы B. pertussis депонировали в коллекции ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Изучены особенности структуры гена ptxP, кодирующего промоторную область коклюшного токсина, и прослежена динамика его изменения у штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции. Установлено, что у циркулирующих штаммов B. pertussis произошли существенные изменения в структуре этого гена. Появились штаммы, несущие новый «невакцинный» ptxP3-аллель гена, имеющий контрастные мутационные изменения, затрагивающие функциональную область, отвечающую за связывание с BvgA-димером, что приводит к усилению прочности связи и как следствие к увеличению продукции коклюшного токсина. В результате исследования показано, что в настоящее время в популяции штаммов B. pertussis доминируют штаммы с новым «невакцинным» ptxP3-аллелем гена и высокой степенью вирулентности. Формирование популяции возбудителя коклюша идет по пути появления вариабельности в генетической структуре штаммов B. pertussis с возникновением новых «невакцинных» аллелей, имеющих существенные мутационные изменения в генах, кодирующих как основные факторы патогенности, так и их регуляторные структуры, отвечающие за уровень их экспрессии.

Коклюш является воздушно-капельной инфекцией, которая до начала прошлого века занимала первое место по летальности среди четырех детских капельных инфекций (коклюш, корь, скарлатина, дифтерия). Введение массовой иммунизации детского населения в середине прошлого века коренным образом изменило характер течения эпидемического процесса коклюшной инфекции во всем мире и способствовала значительному уменьшению количества случаев заболеваний, тяжести течения болезни и резкому снижению летальности. Однако коклюш до сих пор является одной из десяти причин летальности у детей младенческого возраста, занимает 5-е место в структуре детской смертности, вызванной вакциноуправляемыми инфекциями, и остается серьезной проблемой здравоохранения даже в странах с высоким уровнем вакцинации [1–7]. В России, несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения и высокий уровень охвата профилактическими прививками, до настоящего времени также сохраняются подъемы и спады заболеваемости за счет как непривитых, так привитых, отмечается высокая заболеваемость детей раннего возраста, регистрируются тяжелые формы болезни, летальные исходы, а также увеличилась заболеваемость детей школьного возраста [8–11].

Одной из причин продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша является изменение его биологических (как фенотипических, так и генотипических) свойств. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis, проводимый более чем в 20 странах на 4 континентах, а также в нашей стране, показал, что штаммы B. pertussis подвержены генетической вариабельности, затрагивающей гены, кодирующие основные факторы патогенности возбудителя, что способствует расширению его приспособительных возможностей [1–3, 5–8, 12–17]. Вместе с тем недавние многочисленные исследования показали важность для адаптации болезнетворных микроорганизмов изменений, происходящих в генах, регулирующих экспрессию самих факторов патогенности, которые у возбудителя коклюша находятся под контролем двухкомпонентной регуляторной системы BvgAS [1, 2, 6, 16, 18, 19]. Однако обнаружено, что гены, детерминирующие компоненты системы, также подвержены генетической вариабельности и выявленные мутационные изменения могут приводить к нарушению работы системы [1, 2, 6, 16]. Одним из них является ген ptxP, кодирующий промоторную область коклюшного токсина (КТ), в области которого находятся 6 сайтов связывания с димером BvgA, точность присоединения которого на специфический сайт и прочность образуемой связи влияют на экспрессию гена и, следовательно, на уровень продукции КТ.

Целью настоящего исследования явился анализ особенностей структуры регуляторного гена ptxP у штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России в настоящее время.

Материалы и методы

Объектами исследования служили штаммы B. pertussis, выделенные от больных коклюшем в Москве, Московской, Новосибирской и Владимирской областях в 2000–2010 гг., а также штаммы, выделенные в 1948–1999 гг. (из коллекции ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора). Идентификацию штаммов B. pertussis проводили путем изучения их культурально-морфологических и серологических свойств, как описано в литературе [20]. Молекулярно-генетическое типирование проводили в сотрудничестве с профессором F. Mooi и M. van Gent (National Institute of Public Health and the Environment, Bithoven, Netherlands). Выделение ДНК, амплификацию и секвенирование фрагментов гена ptxР осуществляли согласно протоколу, приведенному в работе F. Mooi и соавт. [6]. Анализ нуклеотидных последовательностей гена ptxР выполняли с применением геномной и программной базы BLAST и базы данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). Охарактеризованные штаммы B. pertussis депонировали в коллекцию ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Результаты и обсуждение

В ходе работы исследовано 117 штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем. В результате секвенирования фрагментов гена ptxP было выявлено 3 варианта последовательности нуклеотидов, которые различались между собой в двух положениях (рис. 1). Так, для варианта 1 и 3 в положении -167 характерным был нуклеотид С, в то время как для варианта 2 – нуклеотид Т. Во втором положении - 65 для варианта 1 и 2 последовательностей нуклеотидов гена ptxР характерным был нуклеотид G, а для варианта 3 – нуклеотид А. Полученные при секвенировании последовательности нуклеотидов полностью соответствовали последовательностям, опубликованным в международной базе данных генотипов EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) и соответствовали трем аллелям гена ptxР: вариант 1 последовательности нуклеотидов соответствовал ptxР1-аллелю, вариант 2 – ptxР2-аллелю и вариант 3 – ptxР3-аллелю гена. Первый аллель этого гена – ptxР1, согласно базе данных, является «вакцинным» аллелем, так как все штаммы, используемые в различных странах мира для производства цельноклеточных вакцин, несут этот аллель гена. Замена нуклеотида С на Т в положении -167 является контрастной и приводит к замене аминокислоты – гистидина (Н) на тирозин (Т) в положении Н57Т промотора КТ. Эти аминокислоты являются полярными, гидрофильными, алифатическими, но имеют следующие различия: гистидин является незаменимой аминокислотой с более низкой молекулярной массой (М=115,16) и высоким показателем изоэлектрической точки (pI=7,6); в то время как тирозин является заменимой аминокислотой с более высокой молекулярной массой (М=181,19) и более низкой изоэлектрической точкой (pI=5,63), т.е. замена нуклеотида С на Т является контрастной. Вторая замена нуклеотида G на А в положении -65 также является контрастной и приводит к замене аминокислоты – глицина (G) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении G22Asp промотора КТ. Эти аминокислоты являются алифатическими, заменимыми, но имеют следующие различия: глицин является неполярной, гидрофильной аминокислотой с более низкой молекулярной массой (М=75,07) и с высоким показателем изоэлектрической точки (pI=5,97), в то время как аспарагиновая кислота является полярной, гидрофобной аминокислотой с более высокой молекулярной массой (М=133,1) и более низкой изоэлектрической точкой (pI=2,77) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/Structure), т.е. замена нуклеотида С на G является контрастной заменой. Следовательно, замены нуклеотидов в положениях -167 и -65 нуклеотидной последовательности гена ptxР, кодирующего промоторную область КТ, являются контрастными заменами. Вторая замена расположена в области, отвечающей за связывание с BvgA-димером в области регуляции транскрипции, что обеспечивает повышенную прочность связи и, как показали исследования [6, 16], приводит к увеличению продукции КТ.

Рисунок 1.

Особенности структуры гена ptxP, кодирующего промоторную область КТ, и динамика ее изменения прослежены при изучении штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции. Обнаружено, что 49 (41,9%) штаммов B. pertussis имели, согласно международной базе данных генотипов GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez), «вакцинный» ptxP1-аллель, 20 (17,1%) штаммов – «невакцинный» ptxP2-аллель и 48 (41%) штаммов несли новый «невакцинный» ptxР3-аллель гена.

При анализе динамики распространения штаммов B. pertussis с различными аллельными вариантами гена ptxР оказалось (рис. 2), что среди штаммов B. pertussis, выделенных в допрививочный период (1948–1959 гг.), 71,4% штаммов имели «невакцинный» ptxР2-аллель и 28,6% штаммов – «вакцинный» ptxР1-аллель. «Невакцинный» ptxР2-аллель, как показано выше, отличается от «вакцинного» ptxР1-аллеля наличием одной «немолчащей» мутации в положении -167 с заменой на аминокислотном уровне (Н57Т) в промоторе КТ. Однако данная мутация расположена за пределами области, содержащей 6 сайтов, отвечающих за связывание с BvgA-димером, влияющим на экспрессию КТ.

Рисунок 2

В последующие годы отмечается постепенное увеличение удельного веса штаммов с ptxР1-аллелем до 36,4% в 1960–1969 гг. и 68,7% в 1970–1979 гг. и уменьшение удельного веса штаммов с ptxР2-аллелем до 63,6% в 1960–1969 гг. и 31,3% в 1970–1979 гг. В 1980–1989 гг. удельный вес штаммов с ptxР1-аллелем составил 94,8%, а с ptxР2-аллелем снизился до 5,2%. Среди штаммов B. pertussis, выделенных в 1990–1999 гг., впервые появились штаммы (в 10,5% случаев) с новым «невакцинным» ptxР3-аллелем гена, которые в последние 10 лет становятся наиболее распространенными (в 92,8% случаев) среди циркулирующих штаммов. Однако по-прежнему сохраняются штаммы с «невакцинным» ptxР2-аллелем (в 5,2% случаев) и «вакцинным» ptxР1-аллелем (в 2,5% случаев). Следовательно, проведенный анализ структуры гена, кодирующего промоторную область КТ, у штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, показал, что в современной циркулирующей популяции штаммов произошли существенные изменения в структуре этого гена. Появились штаммы, несущие новый «невакцинный» ptxP3-аллель гена, имеющий контрастные мутационные изменения, затрагивающие функциональную область, отвечающую за связывание с BvgA-димером, входящим в глобальную регуляторную систему, что приводит к усилению прочности связи и как следствие к увеличению продукции КТ.

Для выявления влияния обнаруженных мутационных изменений, произошедших в структуре гена ptxР и приводящих к серьезным изменениям на аминокислотном уровне, проведены сопоставления вирулентных свойств 15 современных штаммов и структуры этого гена. Исследование проводились in vivo на мышах путем их интраназального заражения и последующего расчета LD50. Оказалось, что все штаммы с высокой и один штамм со средней степенью вирулентности, LD50 которых была < 18,3 млн микробных клеток, несли новый «невакцинный» ptxР3-аллель гена. В то время как среди двух современных слабовирулентных штаммов, LD50 которых значительно превышала критерий оценки слабовирулентности штаммов (>25 млн микробных клеток), один штамм характеризовался новым «невакцинным» ptxР3-аллелем, а другой штамм – старым «вакцинным» ptxР1-аллелем гена. Следовательно, изучение структуры гена ptxР штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в настоящее время в России, показало, что большинство изученных вирулентных штаммов B. pertussis, вызывающих заболевания коклюшем в настоящее время, имеют значительные мутационные изменения в структуре регуляторного гена ptxР – характеризуются «невакцинным» ptxР3-аллелем, что может объяснять высокую продукцию ими КТ. При сопоставлении генетической структуры промоторной области с аллельными вариантами генов ptxA и ptxC, кодирующих субъединицы А- и В-комплексов КТ, оказалось, что в большинстве случаев (91,6%) штаммы с новыми «невакцинными» аллелями этих генов несут и новый «невакцинный» ptxР3-аллель гена, кодирующий промоторную область КТ. Высокая распространенность высоковирулентных штаммов со значительными мутационными изменениями как в генах патогенности, так и в регуляторном гене может указывать на риск подъема заболеваемости коклюшем, который регистрируется с 1990-х годов в различных странах мира. Полученные в работе данные согласуются с наблюдениями зарубежных коллег, показавшими [1, 2, 6, 16, 17], что замещение штаммов со старым «вакцинным» ptxР1-аллелем на штаммы с новым «невакцинным» ptxР3-аллелем наблюдается в 11 странах 4 континентов: Азии, Европе, Северной и Южной Америке и не отмечается в Африке. Широкое распространение в настоящее время штаммов с новым ptxР3-аллелем также подтверждается исследованиями по типированию штаммов возбудителя коклюша в 8 европейских странах c помощью электрофореза в пульсирующем поле (PFGE), которые показали, что в 5 из 8 стран превалируют штаммы одного PFGE-профиля – BpSR11 [5].

Подтверждением значительности произошедших в гене ptxР мутационных изменений являются исследования [6, 16], проведенные в Нидерландах с помощью ELISA, по сравнительному анализу количества продукции КТ штаммами B. pertussis с различными аллельными вариантами этого гена. Установлено, что штаммы B. pertussis, несущие новый «невакцинный» ptxР3-аллель, продуцировали значительно больше (в 1,62 раза) КТ, чем штаммы со старым «вакцинным» ptxР1-аллелем этого гена. Клинико-лабораторные сопоставления показали корреляцию между частотой выделения штаммов с ptxР3-аллелем и ростом числа зарегистрированных заболеваний, более тяжелым клиническим течением, а также сдвигом преобладания заболевания в сторону старших возрастных групп населения. Распространение штаммов с этим аллелем гена также связано с подъемом заболеваемости коклюшем в Финляндии, где в 2003 г. наблюдалась эпидемия в масштабе всей страны.

Важным остается вопрос о том, есть ли связь между вакцинацией и штаммами с новым «невакцинным» ptxP3-аллелем. Некоторые данные могут свидетельствовать в пользу этого предположения. Во-первых, штаммы с таким аллелем регуляторного гена не встречались в допрививочный период. Кроме того, штаммы с ptxP3-аллелем выделены в высоком проценте случаев у вакцинированного населения в 1990-х годах, их не обнаружили в Сенегале, где массовую вакцинопрофилактику ввели лишь в 1987 г. [17]. Созданные на основе математического моделирования вакцины для уменьшения роста патогенности могут приводить к эволюции возбудителей с более высоким уровнем вирулентности [21]. Поэтому можно полагать, что замещение штаммов на штаммы с новой генетической структурой произошло вследствие изменения ситуации в результате вакцинации. У лиц, которые получили первый комплекс вакцинации, увеличенная продукция КТ может замедлять эффективный иммунный ответ, ускорять передачу и, следовательно, приспособленность возбудителя [22]. В свою очередь увеличенная продукция КТ также может быть полезна возбудителю, так как для его нейтрализации требуются более высокие уровни антитоксических антител. Антигенная дивергенция между вакцинными и современными штаммами может действовать синергидно с ptxP3-полиморфизмом посредством увеличения передачи возбудителя привитыми лицами [6, 16]. Коклюш среди недавно привитых лиц встречается редко, это свидетельствует о том, что адаптация возбудителя не играет существенной роли, если иммунитет не ослаблен. Следовательно, можно полагать, что ослабленный иммунитет и адаптация возбудителя (наряду с другими факторами) могут способствовать широкой его циркуляции и возникновению подъемов заболеваемости коклюшем.

Таким образом, в настоящее время в популяции штаммов B. pertussis доминируют штаммы с новым «невакцинным» ptxP3-аллелем гена, кодирующим промоторную область КТ, и имеющие высокую степень вирулентности. Полученные нами результаты и данные зарубежных исследователей позволяют говорить о клональной перестройке циркулирующей популяции возбудителя коклюша, которая проходит по пути появления вариабельности в генетической структуре штаммов B. pertussis с возникновением новых «невакцинных» аллелей, имеющих существенные мутационные изменения в генах, кодирующих как основные факторы патогенности, так и их регуляторные структуры, отвечающие за уровень их экспрессии.


Литература


1. Advani A., van der Heide H.G.J., Hallander H.O., Mooi F.R. Analysis of Swedish Bordetella pertussis isolates with three typing methods: characterization of an epidemic lineage. J. Microbiol. Methods 2009; 78: 297–301.
2. Advani A., Gurstafsson L., Ahren C. et al. Appearance of fim3 and ptxP3 –Bordetella pertussis strains in two regions of Sweden with different vaccination program. Vaccine 2011;
29: 3438–3442.
3. Cassiday P., Sanden G., Heuvelman K. et al. Polymorphism in Bordetella pertussis pertactin and pertussis toxin virulence factors in the United States, 1935–1999. J. Infect. Dis. 2000;
182: 1402–1408.
4. De Melker H.E., Schellekens J.F., Neppelenbroek S.E. et al. Reemergence of pertussis in the highly vaccinated population of The Netherlands: observations on surveillance data. Emerg. Infect. Dis. 2000; 6: 348–357.
5. Hallander H., Advani A., Riffelmann M. et al. B. pertussis strains circulating in Europe in 1999 to 2004 as determined by pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 2007; 45 (10): 3257–3262.
6. Mooi F.R., van Loo I.H.M., van Gent M. et al. Bordetella pertussis with increased pertussis toxin production associated with pertussis resurgence. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15: 1206–1213.
7. van Amersfoorth S.C.M., Schouls L.M., van der Heide H.G.J. et al. Analysis of Bordetella pertussis populations in European countries with different vaccination policies. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 2837–2843.
8. Борисова О.Ю., Петрова М.С., Мазурова И.К. и др. Особенности коклюшной инфекции в различные периоды эпидемического процесса в г. Москве. Журн. эпидемиол. и вакцинопрофилактика 2010; 4: 33–39.
9. Лыткина И.Н., Чистякова Г.Г., Филатов Н.Н. Заболеваемость коклюшем в Москве и организация мероприятий по ее снижению. Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация 2004; 35: 8–9.
10. Петрова М.С., Сигаева Л.А., Попова О.П. и др. Особенности эпидемиологии и клиники коклюша в период эпидемического неблагополучия. В кн.: Проблемы инфекционных болезней: Сборник науч. трудов. Часть 1. М., 2000: 80–86.
11. Чистякова Г.Г., Борисова О.Ю., Лыткина И.Н. и др. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве на современном этапе. ЖМЭИ 2005; 5: 35–40.
12. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю. и др. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных
коклюшем в г. Москве (1948– 2005 гг.). Мол. медицина 2008; 1: 40–45.
13. Семенов Б.Ф., Захарова Н.С., Мазурова И.К. Подъем заболеваемости коклюшем на фоне массовой вакцинации. Гипотезы, объясняющие этот феномен. ЖМЭИ 2003; 6: 70–73.
14. Шинкарев А.С, Мерцалова Н.У., Мазурова И.К. и др. Современные штаммы Bordetella pertussis: молекулярная и иммунобиологическая характеристика. Журн. микробиол. 2007; 4: 20–25.
15. Borisova O.Y., Kombarova S.Y., Zakharova N.S. et al. Antigenic divergence between B. pertussis clinical isolates from Moscow, Russia, and vaccine strains. J. Clin. Vaccine Immunol. 2007; 28: 234–238.
16. Mooi F.R. Bordetella pertussis and vaccination: The persistence of a genetically monomorphic pathogen. J. infection, genetics and evolution 2010; 10 (1): 36–49.
17. Preziozi M.P., Yam A., Wassilak S.G. et al. Epidemiology of pertussis in a West African community before and after introduction of a widespread vaccination program. Am. J. Epidemiol. 2002; 155 (10): 891–896.
18. Каратаев Г.И. Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша: Автореф. дис… д-ра биол. наук. М., 2008.
19. Cummings C.A., Bootsma H.J., Relman D.A., Miller J.F. Speciesand strain-specific control of a complex, flexibe regulin by Bordetella BvgAS. J. Bacteriol. 2006; 188: 1775–1785.
20. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше. М., 1984. 23 с.
21. Gandom S., Day T. The evolutionary epidemiology of vaccination. Journal of the Royal Society 2007; 4(16): 803–817.
22. Carbonetti N.H., Artamonova G.V., Van Rooijen N., Ayala V.I. Pertussis toxin target airway macrophages to promote B. pertussis infection of the respiratory tract. Infect. Immun. 2007; 75: 1713–1720.


Об авторах / Для корреспонденции


Борисова Ольга Юрьевна, д-р мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. диагностики дифтерийной инфекции ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора
Адрес: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10
Телефон: (8-495)459-21-46
E-mail: olgaborisova@mail.ru


Похожие статьи


Бионика Медиа