Вирус гриппа ежегодно поражает до 20% населения земного шара и вызывает до 1 млн случаев с летальным исходом. Особенно велика смертность в группах риска – среди детей, пожилых людей, беременных женщин и людей с ослабленной иммунной системой. Серьезной угрозой для человечества являются пандемии гриппа, которые происходят в среднем 3–4 раза в столетие и характеризуются очень быстрым распространением и захватом целых континентов или всего земного шара, с процентом заболеваемости, значительно превышающим обычный, и высокой летальностью во всех группах населения. Так, в 2009 г. в циркуляции появился новый вирус гриппа сероподтипа H1N1 (A/California/07/2009), который быстро распространился по всему миру и вызвал первую пандемию ХХI века. Штамм, безусловно относящийся к сероподтипу H1N1, тем не менее значительно отличался по молекулярной структуре от циркулировавших ранее сезонных вирусов. В связи с этим возникла необходимость срочной вакцинации всех слоев населения.

Сегодня, наряду с уже повсеместно циркулирующим калифорнийским штаммом А (H1N1), потенциальную угрозу пандемии несут высокопатогенные вирусы гриппа птиц, которые преодолели видовой барьер и могут передаваться от птиц к человеку. В дальнейшем могут произойти новые генетические изменения, которые позволят вирусам данного сероподтипа передаваться непосредственно от человека к человеку. Поэтому возникла насущная необходимость подготовки резервных вакцинных штаммов против птичьего гриппа, которые необходимо иметь на случай неожиданного появления в циркуляции вирусов гриппа, подобных птичьим.

Вакцинопрофилактика как живыми (ЖГВ), так и инактивированными (ИГВ) вакцинами остается основным средством борьбы с гриппом. В последние годы интерес к живой гриппозной холодоадаптированной (ХА) реассортантной вакцине значительно возрос. Отчасти это связано с тем, что Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) признала преимущества применения ЖГВ по сравнению с ИГВ в случае наступления пандемической ситуации [1]. Основной задачей, поставленной ВОЗ в глобальном плане подготовки к борьбе с гриппом и защиты от пандемий, является создание коллекции вакцинных штаммов против пандемически потенциально опасных вирусов, которые, в случае наступления пандемической ситуации, могут быть немедленно востребованы для производства [2]. Поэтому обеспечение населения России собственной ЖГВ против потенциально опасных вирусов гриппа имеет важное стратегическое значение.

Современные ЖГВ представляют собой аттенуированные штаммы вирусов гриппа, полученные методом генетической реассортации актуального циркулирующего вируса гриппа с безвредным для человека ХА штаммом устаревшей антигенной структуры – донором аттенуации. Вакцинные штаммы являются так называемыми 6:2 реассортантами, содержащими 2 поверхностных антигена – гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA) от актуальных вирусов гриппа A (H1N1), A (H3N2) и В. 6 генов, кодирующих внутренние белки, наследуются от доноров аттенуации. В мире лицензированы 2 реассортантные ЖГВ – отечественная вакцина и «FluMist» (США). Отдел вирусологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Санкт–Петербург) является единственным в России структурным подразделением, на которое приказом Минздрава России возложена обязанность ежегодной подготовки штаммов ЖГВ.

В настоящем исследовании сделана попытка применить метод классической реассортации, который более 40 лет успешно используется при подготовке штаммов сезонной ЖГВ, для создания штаммов ЖГВ на основе высокопатогенных вирусов гриппа птиц.

Материалы и методы

Вирусы. В работе использованы реассортантные вакцинные штаммы для ИГВ, подготовленные на основе различных, в том числе высокопатогенных, штаммов вируса гриппа А, и донора высокой урожайности – вируса A/PR/8/34 (H1N1) (PR8), полученные в Центре по контролю за заболеваемостью (CDC, Атланта, США) и из коллекции NIBSC (Великобритания), а также ХА донор аттенуации отечественной ЖГВ – A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Л/17) из коллекции отдела вирусологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Санкт-Петербург) (табл. 1). Вирусы поддерживали путем пассажей в 10дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Реассортацию эпидемических вирусов с донорами аттенуации проводили по стандартной методике [3, 4] в РКЭ. Получение вакцинных штаммов включает в себя скрещивание при 32 °C родительских вирусов (донора аттенуации и эпидемического вируса, взятых в равных дозах), селективные пассажи в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной до 25–26 °C температуре инкубации и клонирование реассортантов предельными разведениями.

Таблица 1.

Температурочувствительность реассортантов оценивали по результатам их титрования в РКЭ, инкубированных при оптимальной (32 °С) и повышенной (40 °С) температуре и выражали в виде разницы между титрамим вируса при оптимальной и при повышенной температуре инкубации (RCT, Reproductive Capacity at different Temperatures):

RCT40 = (lg ЭИД50/мл при 32 °С) – (lg ЭИД50/мл при 40 °С).

Вирусы считали температурочувствительными (ts-фенотип), если RCT40 составляла не менее 5 lg ЭИД50/мл, и температуроустойчивыми (non-ts-фенотип), если этот показатель не превышал 3 lg ЭИД50/мл. ХА считали штаммы, для которых RCT25 не превышала 3 lg ЭИД50/мл.

Анализ генома реассортантных штаммов проводили с помощью стандартного метода рестрикционного анализа [5].

Животные. Морские свинки (самки-альбиносы) весом 300–350 г, полученные из Питомника лабораторных животных «Рапполово» РАМН. Работа с животными проводилась в соответствии с «Правилами лабораторной практики» [6]. Титры сывороточных антител определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), которую ставили по методике, регламентированной для испытания иммуногенной активности гриппозных вакцин [7] с использованием 4 АЕ антигена и 1% взвеси эритроцитов кур.

Результаты и обсуждение

Методом классической реассортации вирусов H5N1–PR8 с донором аттенуации Л/17 были получены реассортантные штаммы, одновременно наследующие либо гены NA и РВ2 от донора аттенуации, либо NA птичьего вируса и ген РВ2 вируса PR8 (табл. 2).

Таблица 2.

Примечание. n – число реассортантов. В скобках – процент.

Дальнейший анализ генома показал, что реассортанты, унаследовавшие гены NA и РВ2 от ХА донора, получили от него и все остальные гены за исключением НА, то есть обладали так называемой формулой генома 7:1. При этом полученные штаммы обладали температурочувствительностью и холодоадаптированностью – свойствами, характерными для вакцинных штаммов сезонной ЖГВ с классической формулой генома 6:2, и стимулировали у экспериментальных животных гуморальный иммунный ответ, сопоставимый с таковым у животных, зараженных родительскими вирусами H5N1–PR8 (табл. 3).

Таблица 3.

*Среднегеометрические титры гуморальных антител через 8 нед после введения вируса морским свинкам (по данным РТГА).

Чтобы понять, является ли такая прочная связь гена нейраминидазы вирусов гриппа птиц с геном РВ2 от вируса PR8 свойством именно реассортантов H5N1–PR8 или любых реассортантов, подготовленных на основе вируса PR8, была предпринята попытка заместить внутренними генами ХА донора аттенуации Л/17 внутренние PR8гены реассортантных штаммов для сезонной ИГВ. В качестве таких реассортантов были использованы штаммы, предоставленные NIBSC в качестве кандидатов для сезонной инактивированной гриппозной вакцины – реассортант IRV148 на основе вируса A/Brisbane/59/2007 (H1N1) и реассортант NIB64 на основе вируса A/Perth/16/2009 (H3N2).

При скрещивании IRV148 и NIB64 с донором аттенуации Л/17 было получено соответственно 28 и 9 реассортантов (см. табл. 2).

Было показано, что все 28 реассортантных штаммов, полученных на основе вируса IRV148, унаследовали ген РВ2 от донора аттенуации, а HA и NA – от «дикого» родительского штамма. Из 9 реассортантов вируса NIB64 5 унаследовали ген РВ2 от донора Л/17, а HA и NA – от «дикого» вируса.

Таким образом, была продемонстрирована возможность разрыва достаточно жесткой констелляции генов РВ2+NA у PR8-ассортантов, несущих HA и NA сезонных штаммов вируса гриппа. Можно предположить, что невозможность переноса в ХА реассортантный штамм РВ2 гена от донора аттенуации, а NA – от вируса гриппа птиц является уникальной особенностью вирусов H5N1–PR8.

Сегодня потенциальную угрозу представляют не только продолжающие циркулировать штаммы А (H1N1) калифорнийского («свиного») гриппа [8], но и несущие пандемический потенциал высокопатогенные вирусы гриппа птиц A (H5N1) [9, 10]. Использование этих высокопатогенных вирусов для производства ЖГВ осложнено необходимостью проведения вирусологической работы в особых условиях безопасности. Поэтому при подготовке резервных вакцинных штаммов ЖГВ сероподтипа A (H5N1), которые необходимо иметь на случай неожиданного появления в циркуляции вирусов гриппа, подобных птичьим, нами был предпринят обходной маневр – в качестве источника поверхностных антигенов НА и NA были использованы не сами высокопатогенные вирусы гриппа птиц А (H5N1), а реассортантные штаммы для ИГВ, подготовленные на их основе с помощью методов обратной генетики (организации-производители штаммов – NIBSC, Великобритания и CDC, США) – так называемые H5N1–PR8 реассортанты. Они обладают модифицированными HA и NA от патогенных вирусов гриппа птиц, а внутренними генами – от высокорепродуктивного вируса A/PR8/8/34 (H1N1). Удаленный генно-инженерным путем полиосновный сайт протеолиза в НА(Н5) снижает патогенность этих вирусов [11], что делает их безопасными для естественных хозяев и персонала. Мы полагали, что, используя подобные модифицированные генно-инженерным путем вирусы H5N1–PR8, приемами классической реассортации в куриных эмбрионах можно получать штаммы для ЖГВ к высокопатогенным вирусам гриппа птиц А (H5N1) путем замещения 6 внутренних генов в геноме H5N1–PR8 реассортантов на гены донора аттенуации.

Было показано, что гены PB2 от вируса PR8 и птичья NA всегда наследовались реассортантам и вместе, и наоборот, если в геном реассортантного вируса включался ген РВ2 донора аттенуации, NA также наследовалась от донорского штамма. Таким образом, методами классической реассортации были получены температурочувствительные и ХА реассортантные штаммы с формулой генома 7:1, которые унаследовали от вирусов гриппа птиц только ген НА, а все остальные гены – от донора аттенуации.

В России успешно прошла клинические испытания [12] и зарегистрирована [13] реассортантная моновакцина типа A (H5N2) «Ультрагривак» для профилактики у людей птичьего гриппа, подготовленная на основе апатогенного штамма вируса гриппа птиц A/duck/Potsdam/1402–6/86 (H5N2) и донора аттенуации Л/17, имеющая формулу генома 7:1. Подготовленные нами на основе высокопатогенных вирусов гриппа птиц H5N1 7:1 реассортанты после однократной интраназальной иммунизации вызывали у экспериментальных животных выраженный иммунный ответ, сопоставимый с таковым на введение H5N1–PR8 родительских штаммов.

Нам не удалось получить реассортанты с классической вакцинной формулой генома 6:2, но несмотря на это результаты проведенного исследования позволяют надеяться, что подготовленные температурочувствительные и ХА штаммы с формулой генома 7:1 в случае наступления пандемической ситуации смогут служить основой для производства ЖГВ против пандемически опасного птичьего гриппа A (H5N1).

Выводы

Все попытки получить штамм, содержащий не только НА, но и NA птичьего происхождения, были безрезультатны.

Трудности получения реассортантов с формулой генома 6:2 при скрещивании донора аттенуации Л/17 с вирусами H5N1–PR8 можно объяснить особенностями жесткой констелляции генов указанных вирусов.

Была выявлена прочная связь между генами PB2/PR8 и птичьей NA, которые всегда наследовались реассортантами вместе. Если в геном реассортантного вируса включался ген РВ2 донора аттенуации, NA также наследовалась от него.

Классический метод реассортации, широко используемый для подготовки штаммов сезонной ЖГВ на основе циркулирующих вирусов гриппа человеческого происхождения, не применим к работе с реассортантными вирусами H5N1–PR8 и требует оптимизации.