В структуре природно-очаговых инфекций на юге Хабаровского края на протяжении последних лет традиционно лидирует клещевой риккетсиоз (КР) [1, 2]. Из-за отсутствия средств специфической профилактики заболеваемость КР остается неуправляемой и растет из года в год. В частности, по данным Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Хабаровскому краю, заболеваемость КР в 2022 г. в сравнении с 2021 г. выросла в 3,2 раза и составила 16,09 на 100 тыс. населения1. Экономическая составляющая этой проблемы достаточно велика, учитывая растущую заболеваемость, существенную долю трудоспособного населения среди заболевших, стоимость стационарного лечения. При этом изучение отдельных механизмов патогенеза заболевания с целью совершенствования патогенетической терапии не утрачивает актуальности.
Оксидативный стресс – один из важнейших компонентов, формирующих патогенез большинства патологических состояний [3]. Селен (Se) – биологически значимый микроэлемент, входящий в состав активных центров антиоксидантных ферментов, обусловливающих защиту от свободнорадикального окисления [4]. Оксидативный стресс, отражающий баланс между производством и утилизацией кислородсодержащих свободных радикалов с последующим восстановлением поврежденных клеточных макромолекул и мембран [5], происходит, когда образованные во внеклеточном окружающем пространстве или в пределах клетки свободнорадикальные комплексы превышают внутриклеточную антиоксидантную защиту. Последняя представлена в организме ферментативными и неферментативными антиоксидантными механизмами. Особую роль играет система глютатиона и тиоредоксинредуктазы с акцентированными компонентами в виде селенсодержащих энзимов [4, 5]. Образованию инициатора перекисного окисления липидов – гидроксил-радикала – препятствует участвующий в формировании перекисной резистентности фермент глютатионпероксидаза.
Согласно данным современных исследований, в России более чем у 80% населения обеспеченность Se ниже оптимальной [6]. В частности, Хабаровский край рассматривается как Se-дефицитная территория [7], так как у здоровых жителей юга Хабаровского края уровень Se в сыворотке крови составляет 70–90 мкг/л, то есть 60–80% от оптимальной величины.
В доступной литературе мы не обнаружили результатов исследований взаимосвязи селенового статуса и активности процессов формирования реакционных активных форм кислорода у больных КР.
Целью настоящего исследования явилось определение взаимосвязи между уровнем Se и оксидативным статусом у больных КР, обусловленным Rickettsiae heilongjiangensis, для понимания патогенеза, оценки тяжести течения и возможного прогноза заболевания.
Материалы и методы
В соответствии с международными этическими требованиями (Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации), предъявляемыми к медицинским манипуляциям с участием человека, после подписания письменного информированного согласия проведено проспективное клинико-лабораторное обследование 80 пациентов (40 мужчин и 40 женщин) с КР, обусловленным R. heilongjiangensis, без сопутствующих хронических заболеваний в стадии декомпенсации, находившихся на стационарном лечении в инфекционном отделении Городской клинической больницы им. профессора А.М. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения Хабаровского края. В исследование были включены больные только со среднетяжелой формой КР, которые доминировали среди госпитализированных. Средний возраст пациентов – 61 год (52,5–69).
В группу сравнения вошли 30 чел. (18 мужчин и 12 женщин), условно здоровых, сопоставимых по возрасту (p < 0,05).
Диагноз КР установлен на основании характерных клинико-эпидемиологических данных (высокая лихорадка, макуло-папулезная сыпь, первичный аффект в месте присасывания клеща, пребывание в зоне возможного обитания переносчиков инфекции, сезонность).
Во всех случаях заболевания диагноз был подтвержден выделением ДНК R. heilongjiangensis из сыворотки крови с помощью наборов «РеалБест ДНК Rickettsiae species», «РеалБест ДНК Rickettsiae sibirica/Rickettsiae heilongjiangensis» (АО «Вектор-Бест», Новосибирск).
При поступлении в инфекционное отделение (в разгар заболевания) у пациентов производили забор венозной крови для определения уровня Se и некоторых показателей свободнорадикального окисления в сыворотке крови.
Исследование уровня Se в сыворотке крови проводили в токсикологической лаборатории НИИ питания РАН (Москва) флуориметрическим методом. В каждой серии определений применяли референс-стандарты сыворотки крови N23-KT (Nippan Co) с регламентированным содержанием Se 88 мкг/л.
Интегральную оценку процессов свободнорадикального окисления в сыворотке крови осуществляли методом хемилюминесценции (ХЛ) с использованием люминесцентного спектрометра LS 50B (Perkin Elmer Inc.) в Центральной научно-исследовательской лаборатории Дальневосточного государственного медицинского университета (ФГБОУ ВО ДВГМУ) Минздрава России. Для исследования спонтанной и индуцированной Fe2+ ХЛ определяли:
- Ssp – светосумму спонтанной ХЛ, коррелирующую с интенсивностью образования активных кислородных форм;
- H – индуцированную ХЛ, отражающую наличие гидроперекисей липидов;
- Sind-1 – светосумму, указывающую на скорость накопления продуктов перекисного окисления липидов.
Кинетику ХЛ, инициированную H2O2 в присутствии люминола [1], анализировали по трем параметрам:
- Slum – светосумме в присутствии люминола, указывающей на интенсивность формирования гидроксил-радикалов;
- H – максимуму свечения, свидетельствующего о потенциальной способности субстрата к перекисному окислению;
- Sind-2 – светосумме, обратно пропорциональной активности антиоксидантной антирадикальной защиты.
Интенсивность ХЛ рассчитывали на 1 мл сыворотки и выражали в относительных единицах.
Математическую обработку полученных данных проводили согласно «Статистическому анализу в публикуемой литературе (SAMPL)» непараметрическими методами на персональном компьютере на базе процессора Intel® Core ® i3-7300, операционной системы Windows 10 с использованием программы Microsoft Office Excel 2007. Определяли средние величины (M), ошибку средней (m), медиану (Ме) и интерквартильный интервал (IQR) [25%; 75%].
Для сравнения численных характеристик использовали t-критерий Стьюдента, а для анализа зависимости непараметрических данных – коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Критический уровень значимости при проверке гипотез p < 0,05.
Проведение исследовательской работы одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ДВГМУ (протокол № 3 от 16.06.2020).
Результаты
Для наглядности участники исследования были разделены на группы:
- 1-я – пациенты с КР в разгар заболевания (п = 80);
- 2-я – пациенты с КР в периоде реконвалесценции (п = 80);
- 3-я – группа сравнения (п = 30).
Уровень Se у обследованных пациентов с учетом периода заболевания представлен на рисунке.
Все пациенты, участвующие в исследовании, постоянно проживали на селенодефицитной территории Хабаровского края и, следовательно, находились в равных условиях с респондентами, представленными в 3-й группе. Следует отметить, что ни в одной группе уровень Se в сыворотке крови не был оптимальным (115–120 мкг/л). У всех пациентов в разгар заболевания выявлен дефицит Se (20–70 мкг/л). При этом тяжелый дефицит, характеризующийся уровнем микронутриента в значениях 20–51 мкг/л, зафиксирован у 70% пациентов 1-й группы, что статистически достоверно выше, чем в 3-й группе (р1–3 < 0,05) [6, 7].
Уровень Se у пациентов 2-й группы оставался в пределах 20–51 мкг/л в 46,25% случаев, статистически значимо отличаясь от показателей 1-й (р1–2 < 0,01) и 3-й группы (р2–3 < 0,05).
Легкий дефицит Se (51–70 мкг/л) выявлен у 30% пациентов в 1-й группы и у 53,75% – во 2-й (р1–2 < 0,01).
Средний уровень Se в сыворотке крови у пациентов 1-й группы по сравнению с пациентами 3-й группы был статистически значимо снижен в 1,7 раза (p1-3 < 0,01) (см. таблицу).
Во 2-й группе выявлено статистически значимое повышение среднего уровня Se в сыворотке крови по сравнению с показателями 1-й группы в 1,13 раза (р1–2 < 0,01), но по-прежнему достоверно отличающееся от показателей 3-й группы (р1–3 < 0,01).
Обсуждение
При анализе ХЛ в сыворотке крови больных КР 1-й группы выявлены статистически значимые различия всех исследуемых показателей с аналогичными в 3-й группе, свидетельствующие о выраженной активации процессов свободнорадикального окисления:
- более чем четырехкратное усиление интенсивности генерации свободных радикалов (Ssp) (p1–3 < 0,05);
- существенное усиление продукции гидроксильных (Slum) (p1–3 < 0,001) и перекисных (Sind-1) радикалов – в 3,9 раза (p1–3< 0,001);
- повышение концентрации гидроперекисей липидов (h) в 3,5 раза (p1–3 < 0,01), свидетельствующее об активации начального этапа процессов пероксидации липидов;
- превышение перекисной резистентности (H) в 6,4 раза (p1–3 < 0,05), указывающее на потенциальную способность к перекисному окислению,
Наравне с активацией процессов свободнорадикального окисления отмечено существенное угнетение активности антиоксидантной антирадикальной защиты (Sind-2) в 4,5 раза (p1–3 < 0,05).
В период реконвалесценции все исследуемые показатели оксидативного статуса в сыворотке крови оставались достоверно повышенными к аналогичным как в 3-й, так и 1-й группе, причем относительно последней имелась тенденция к дальнейшему росту, на что указывало накопление свободнорадикальных генераций более чем в 1,3 раза.
Следует отметить, что именно гидроксильные и перекисные радикалы, являющиеся наиболее реакционно-способными, выступают индукторами перекисного окисления липидов, способствуя повреждению клеток [8].
Так как Se участвует в формировании перекисного гомеостаза, нивелирующего образование токсичных перекисных радикалов [9], представлялось интересным утверждать, что предельно низкий его уровень не может оказывать сдерживающего влияния на активацию свободнорадикальных процессов.
Проведенный анализ на основе коэффициента ранговой корреляции Спирмена показал наличие достоверной обратно направленной связи средней силы в разгар заболевания между содержанием Se в сыворотке крови и некоторыми ХМЛ-показателями, указывающими на активацию перекисных радикалов (для Ssp r = -0,39, p < 0,01; h – r = -0,31, p < 0,05; Sind-1 – r = -0,40, p < 0,01), и достоверной прямо направленной связи средней силы между исследуемым эссенциальным микроэлементом и ХЛ-показателями, определяющих антиоксидантную антирадикальную защиту (Sind-2 r = 0,38, p < 0,05).
Таким образом, выявлена взаимосвязь между снижением содержания Se и генерацией кислородсодержащих свободных радикалов в сыворотке крови больных КР, обусловленным R. heilongjiangensis, в разгар заболевания. Вероятно, низкую концентрацию микроэлемента, являющегося кофактором антиоксидантной системы, можно объяснить истощением его эндогенных запасов в результате активации процессов свободнорадикального окисления в организме.
В дальнейших исследованиях целесообразно использовать эпидемиологические показатели в качестве количественных критериев тяжести заболевания и формирования прогноза.
Выводы
1. Содержание Se в сыворотке крови больных среднетяжелой формой КР в разгар заболевания достоверно снижено по сравнению с показателями в группе сравнения, что характеризуется как дефицит этого микронутриента.
2. Дефицит Se сохраняется в периоде реконвалесценции, повышаясь по сравнению с разгаром заболевания; уровень микроэлемента остается достоверно сниженным относительно показателей в группе сравнения.
3. В сыворотке крови пациентов с КР в период разгара заболевания отмечаются инициация процессов свободнорадикального окисления и резкое подавление мобилизации антиоксидантной антирадикальной защиты.
4. В периоде реконвалесценции у пациентов с КР, несмотря на угасание основных клинических проявлений заболевания, активность процессов свободнорадикального окисления продолжает нарастать, что свидетельствует о незавершенности патологического процесса.
5. Между хемилюминесцентными параметрами короткоживущих активных форм кислорода и содержанием Se в сыворотке крови пациентов с КР установлена достоверная обратно направленная средней силы корреляционная связь.
6. Выявлена прямая средней силы корреляционная связь между выраженностью антиоксидантной антирадикальной защиты и селеновым статусом пациентов.
7. Целесообразна коррекция уровня Se у пациентов с КР для активации антиоксидантной антирадикальной защиты.
