Внебольничные пневмонии (ВП), несмотря на современные методы диагностики и лечения, продолжают оставаться значимой медико-социальной проблемой, поскольку занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности пациентов от осложнений инфекционных заболеваний. Согласно данным ВОЗ, ежегодный показатель заболеваемости ВП в мире составляет 1000–1200 на 100 тыс. населения [1]. В Российской Федерации общее число больных ВП ежегодно превышает 1,5 млн чел. [2].
Ведущим этиологическим фактором ВП являются Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae spp. и др. [3]. К атипичным возбудителям ВП бактериальной природы относят Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila, Chlamydophila psittaci и Coxiella burnetii [4]. Значительное место в этиологии ВП занимают респираторные вирусы человека – вирусы гриппа, коронавирусы, риносинцитиальный вирус, метапневмовирус и бокавирус [5]. Ряд авторов предлагают рассматривать ВП как микст-инфекцию бактериально-вирусного генеза [6].
Особый вклад в эпидемиологию ВП внесла пандемия новой коронавирусной инфекции COVID-19, вызванная коронавирусом (SARS-CoV-2). Так, по данным Росздравнадзора, в 2021 г. число заболевших ВП в России повысилось на 258%, составив 2 722 292 чел. [7]. Существенная роль в патогенезе COVID-19 с развитием ВП отводится изменению цитокинового профиля крови на разных стадиях заболевания [8]. Однако исследований по изучению уровня цитокинов в мокроте у пациентов с ВП ранее не проводили.
Цель исследования – сравнительный анализ микробного профиля и уровня цитокинов: интерлейкина-4, -6, -10 (ИЛ-4, -6, -10) и интерферона-гамма (ИФН-γ) в образцах мокроты больных ВП в период пандемии COVID-19.
Материалы и методы
Исследование выполнено на базе Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора.
Материалом для исследования послужили образцы мазков из носо/ротоглотки и мокроты 315 больных ВП, находившихся в период с 2021 по 2022 г. на стационарном лечении в инфекционных отделениях г. Ростова-на-Дону и Ростовской области. Диагноз «внебольничная пневмония» (J18.9) у всех пациентов был верифицирован в соответствии с Российскими национальными рекомендациями по ВП (2019) на амбулаторном этапе диагностики в первые 5–7 дней заболевания с последующей госпитализацией в специализированный стационар [10]. Среди участников исследования было 146 мужчин и 169 женщин. Возраст пациентов колебался от 20 до 80 лет: 20–50 лет – 157 чел., 51–80 лет – 158.
Согласно сопроводительной медицинской документации, мазки из носо/ротоглотки были взяты у больных ВП непосредственно в момент их поступления в инфекционный стационар, что соответствовало 6–8-м суткам от начала заболевания. Правила сбора, хранения, транспортировки и исследования образцов биоматериала соответствовали требованиям методической документации1–4.
Молекулярно-генетическое исследование образцов мокроты проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) real time на амплификаторах серии «ДТпрайм» («ДНК-технология», Россия). Были использованы коммерческие наборы реагентов «РИБО-преп», «Реверта-L», «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL», «АмплиСенс Influenza virus A/B-FL», «АмплиСенс Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumonia-FL», «АмплиСенс Legionella pneumophila-FL» (Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия), «ВекторПЦРрв-2019-nCoV-RG» (ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Россия). Бактериологическое исследование образцов проводили классическим количественным методом с разведением в физиологическом растворе 1:2 и посевом на стандартные дифференциально-диагностические среды. Для выявления Str. pneumoniae, H. influenza и Streptococcus spp. применяли 5% кровяной агар и шоколадный агар с селективной добавкой для выделения пневмококков (СД-П) (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия). Последующую идентификацию выделенных штаммов бактерий осуществляли с помощью времяпролетной масс-спектрометрии на аппарате MALDI-TOF Microflex Biotyper (BrukerDaltonics, Германия) и микробиологического анализатора Vitek 2 Compact (bioMeriux SA, Франция). Резистентность к антимикробным препаратам проверяли диско-диффузионным методом на среде Мюллера–Хинтон в соответствии с МУК 4.2.1890-04 и Клиническими рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (версия 2018-03).
Исследование в мокроте уровней ИФН-γ, ИЛ-10, -6, -4 осуществляли с помощью постановки твердофазного «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа (тест-системы «Вектор-Бест», Россия). Учет результатов проводили на анализаторе с инкубатором Multiskan FC (США).
Статистическую обработку данных выполняли с использованием программы Exсel 2013. Сравнение количественных показателей выполнено с применением t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты
На первом этапе исследования у всех больных ВП (n = 315) была выполнена ПЦР мазков из носо/ротоглотки. РНК SARS-CoV-2 в представленных образцах была обнаружена у 212 (67%) пациентов. У 103 (33%) больных результаты ПЦР были отрицательными.
Дальнейшую работу проводили с биоматериалом тех пациентов, у которых РНК SARS-CoV-2 не была обнаружена. Выполненная у этих лиц повторно ПЦР из мокроты позволила обнаружить РНК SARS-CoV-2 в 44,7% случаев (n = 46). Эти больные на втором этапе исследования составили 1-ю группу (n = 46), во 2-ю были включены больные с отрицательными результатами ПЦР мокроты (n = 57).
Дальнейшее молекулярно-биологическое исследование показало, что удельный вес пациентов, в образцах мокроты которых удалось обнаружить РНК Human сoronavirus (ОС43, Е229, NL63, HKUI), составил в 1-й группе 6,5 ± 3,6%, во 2-й – 12,3 ± 4,3% (р < 0,05), РНК Human respiratory syncytialvirus – 4,3 ± 2,9 и 15,8 ± 4,8% (р < 0,05), РНК Human metapneumovirus – 4,3 ± 2,9 и 15,8 ± 4,8% соответственно (р < 0,05).
Относительное число пациентов с выделенной в мокроте РНК Human parainfluenza virus 1–4 в 1-й группе оказалось также достоверно выше, чем во 2-й – 15,2±5,3 и 24,6±5,7% соответственно (р < 0,05). РНК Human rhinovirus была обнаружена в 1-й группе в 2,2 ± 2,2% случаев, а во 2-й значительно чаще – в 10,5 ± 4,06% (р < 0,05). Удельный вес пациентов 1-й группы с выявленными в образцах мокроты ДНК Human adenovirus (B, C, E) составлял 4,4 ± 3,0%, 2-й группы – 1,8 ± 1,8% (р < 0,05), РНК Human bocavirus в 1-й и 2-й группах – 2,2 ± 2,2 и 3,5 ± 2,4% соответственно (р < 0,05).
В образцах мокротах пациентов обеих групп были обнаружены вирусные ассоциации: в 1-й группе чаще всего встречались РНК Human coronavirus (COVID-19) + РНК Human parainfluenza virus 1–4 – 15 ± 5,3%, РНК Human сoronavirus (COVID-19) + РНК Human сoronavirus (ОС43, Е229, NL63, HKUI) – 7 ± 2,8%. Доля ассоциации РНК Human сoronavirus (COVID-19) + РНК Human parainfluenza virus 1–4 + РНК Мuman adenovirus (B, C, E) + РНК Human bocavirus и РНК Human сoronavirus (COVID-19) + РНК Human parainfluenza virus 1–4 + РНК Human rhinovirus совпадала и была равна 6,0 ± 3,5%. Реже встречались ассоциации РНК Human сoronavirus (COVID-19) + РНК Human parainfluenza virus 1–4 + РНК Human сoronavirus (ОС43, Е229, NL63, HKUI); РНК Human сoronavirus (COVID- 19) + РНК Human adenovirus B; РНК Human сoronavirus (COVID- 19) + РНК Human respiratory syncytialvirus + РНК Human metapneumovirus – 4,0 ± 2,9%.
В мокроте пациентов 2-й группы чаще встречались ассоциации РНК Human respiratory syncytialvirus + РНК Human metapneumovirus – 19,0 ± 5,2% и РНК Human parainfluenza virus 1–4 + РНК Human сoronavirus (ОС43, Е229, NL63, HKUI) – у 9 ± 3,7% пациентов.
Также методом ПЦР были диагностированы наиболее значимые, по данным литературы, бактериальные возбудители ВП. Доля пациентов с выявленной ДНК Haemophilus influenza для 1-й группы составляла 4,3 ± 2,9%, для 2-й – 7,0 ± 3,4% (р < 0,05); ДНК Mycoplasma pneumoniaе – 2,2 ± 2,1% 0% (р < 0,05); ДНК Streptococcus pneumoniaе – 0 и 7,0 ± 3,4% (р < 0,05) соответственно.
Бактериологический анализ позволил выявить широкое разнообразие видового состава потенциальных возбудителей ВП: в 1-й группе – 25 видов, во 2-й – 44. Чаще всего в мокротах обеих групп встречались 3 микробных возбудителя, которые могут отягощать течение ВП: грамположительные кокки, представленные в основном Streptococcus, Staphylococcus и дрожжеподобными грибами рода Candida. Распределение в группах произошло следующим образом: в мокроте пациентов 1-й группы частота встречаемости Streptococcus spр. составила 35,7 ± 2,0%, 2-й – 34,0 ± 2,2% (р > 0,05). Подавляющее большинство культур микроорганизмов Streptococcus spp. относилось к микрофлоре слизистой верхних дыхательных путей: Str. salivarius – 34,0 ± 1,5%; Str. oralis – 25,0 ± 1,3%; Str. mitis – 15,0 ± 1,1%; Str. parasanguinis – 11,0 ± 3,1%; Str. pneumoniae – 5,0 ± 2,1%; Str. anginosus – 3,5 ± 1,8%. Редко встречались: Str. acidomitis, Str. perosis, Str. rattii, Str. pseudopneumoniae – 2,0 ± 1,4%, из условно-патогенных стрептококков только у 1,0 ± 1,0% пациентов с лабораторно подтвержденным COVID-19 был изолирован Str. pneumoniae.
Staphylococcus spp. был обнаружен в 1-й и 2-й группах – 25,4 ± 2,2 и 11,8 ± 4,3% соответственно (р <0,05). Staphylococcus был представлен такими видами, как S. haemolyticus – 30,0 ± 1,4% и S. epidermidis – 56,0 ± 1,5%. Патогенный S. aureus был выделен только в 1,0 ± 1,0% биоматериала.
Дрожжеподобные грибы рода Candida были выделены в группах в 47,0 ± 2,3 и 11,2 ± 1,3% образцов соответственно (р < 0,05). По результатам идентификации клинических штаммов грибов рода Candida были выделены (в порядке убывания): C. аlbicans – 59,0 ± 1,5%, C. krusei – 17,0 ± 1,2%, C. lusitaniae и C. glabrata – по 7,0 ± 2,5%. Одновременное выявление бактериально-грибковых ассоциаций было зафиксировано у 30,0±1,4% больных в обеих группах.
Изучение чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам показало, что резистентность по отношению к группам антибиотиков – фторхинолонам II поколения и препаратам нитрофуранового ряда – составляла 57,0 ± 28,1% культур; к аминогликозидам II поколения – 56,0 ± 1,54%; к азалидам, макролидам, цефалоспоринам III поколения, карбапенемам – 54,0 ± 2,8%; к полусинтетическим пенициллинам II поколения – находилась в пределах 39,0 ± 2,8%.
Анализ цитокинового профиля показал, что в образцах мокроты пациентов 1-й группы уровень ИФН-γ составил 89,6 ± 26,5 пг/мл, во 2-й – 121,1 ± 24,6 пг/мл (р < 0,05). Количество ИЛ-4 было равно 3,6 ± 0,9 и 4,1 ± 1,6 пг/мл (р > 0,05); ИЛ-6 – 23,9 ± 6,4 и 42,5 ± 10,5 пг/мл (р > 0,05); ИЛ-10 – 22,1 ± 6,2 и 13,6 ± 3,5 пг/мл во всех случаях соответственно (р < 0,05).
Обсуждение
При сборе мокроты, безусловно, происходит ее контаминация бактериями верхних дыхательных путей, поэтому при статистической обработке результатов учитывался диагностически значимый для мокроты титр количества микроорганизмов [11].
Candida spp. не являются возбудителем пневмоний, но эта флора как в составе микробных ассоциаций, так и как моноинфекция увеличивает продолжительность болезни (с учетом появления устойчивости к противогрибковым препаратам и склонности к формированию биопленок), ухудшая прогноз заболевания [12].
Изменению течения воспалительного процесса может способствовать раннее неконтролируемое использование антибиотиков в сочетании с противовоспалительными средствами на догоспитальном этапе, а также на доклинических стадиях при самых первых проявлениях. В этой связи результаты проведенного исследования, свидетельствующие о сравнительно невысокой продукции противовоспалительных ИЛ-4 и ИЛ-10 на местном уровне в мокроте у больных ВП, являются закономерными и отражают изменение уровня цитокинов в организме в целом как при характерном для пневмоний полиэтиологичном дистресс-синдроме [13, 14]. Для легочного биотопа L.S. Nixon и соавт. отмечали снижение уровня ИЛ-6 при муковисцидозе [15]. Другие авторы свидетельствуют о понижении уровня ИЛ-10 в дыхательных путях при астме и хронической обструктивной болезни легких [16]. В исследовании R. Ribeiro-Rodrigues и соавт. [17] отмечается повышение уровня ИФН-α и ИЛ-8 в мокроте при пневмонии. Эти данные указывают на то, что цитокины в мокроте коррелируют с активностью заболевания во время активного туберкулеза легких.
В качестве маркера тяжести воспаления на местном уровне для прогнозирования течения заболеваний в разных биотопах сотрудниками РостовНИИ микробиологии и паразитологии было предложено учитывать изменение уровня ИЛ-65,6. Полученные результаты делают перспективным изучение изменений цитокинового профиля на местном уровне при пневмониях для уточнения патогенеза пневмонии разной этиологии.
Заключение
Результаты исследования показали, что РНК SARS-CoV-2 у больных ВП были выделены в мазках из носо/ротоглотки (n = 212), в мокроте (n = 103), в мазке из носо/ротоглотки и мокроте одновременно (n = 258).
В структуре микробиоты мокроты у пациентов с ВП в обеих группах преобладала грамположительная кокковая флора, представленная бактериями Streptococcus и Staphylococcus, достоверно отличающимися большой резистентностью к антибиотикам. В ходе проведенного исследования была показана роль дрожжеподобных грибов рода Candida в развитии ВП.
При ВП выявлена гиперпродукция противовоспалительного ИФН-γ. Выраженная разница показателей цитокинов в 1-й и 2-й группах отмечена также для ИЛ-10. Изучение соотношения про- и противовоспалительных цитокинов является перспективным направлением в исследовании механизмов прогрессирования воспаления при пневмонии. Дальнейшее расширенное изучение цитокинового профиля в мокроте позволит прогнозировать тяжесть течения и исход заболевания, а также корректировать лечение.
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
1 Методические указания МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности». М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. 51 с.
2 Методические указания МУ 4.2.3115-13 «Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний». М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2014. 39 с.
3 Методические рекомендации МР 4.2.0114-16 «Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии пневмококковой этиологии». М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2017. 64 с.
4 Методические рекомендации 3.1.0169-20 «Лабораторная диагностика COVID-19». М.: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2020. 20 с.
5 Бусленко А.О., Острые кишечные инфекции: особенности интестинальной микрофлоры и местного цитокинового профиля, оптимизация терапии. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Ростов-на-Дону, 2018.
6 Матузкова А. Н. ВИЧ-инфекция: состояние маркеров системного воспаления и микробиоты ротоглотки, прогноз течения и оптимизация терапии. – инфекционные болезни. Автореф.. дис. … канд. мед. наук. М., 2021.
